引論：我們?yōu)槟砹?篇微生物論文范文，供您借鑒以豐富您的創(chuàng)作。它們是您寫作時的寶貴資源，期望它們能夠激發(fā)您的創(chuàng)作靈感，讓您的文章更具深度。

微生物論文:甘草有益微生物論文

【摘要】植物體內(nèi)大量分布的微生物對植物產(chǎn)生的影響已成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)，特別是那些有益的影響可對植物的生長及活性成分的形成產(chǎn)生一定的作用。甘草作為一種大宗中藥，其栽培品的質(zhì)量一直是人們所關(guān)心的問題，甘草有益微生物對提高甘草的品質(zhì)有重要作用。該文綜述了甘草有益微生物的研究進(jìn)展，以期對提高栽培甘草的質(zhì)量起到指導(dǎo)意義。

【關(guān)鍵詞】甘草;內(nèi)生菌;根瘤菌;菌根真菌

甘草是豆科甘草屬(Glycyrrhiza)植物，其根及根莖為常用中藥，市場需求量大。近年來，隨著野生甘草資源的急劇減少，且國家明令禁止采挖野生甘草，使甘草供求矛盾日益尖銳。在這種情況下，對甘草資源的保護(hù)性利用及栽培甘草勢在必行。近年來，隨著人工甘草種植面積的逐年加大，提高甘草的質(zhì)量成為亟待解決的一個關(guān)鍵問題。相關(guān)研究表明，植物有益微生物可以產(chǎn)生促植物生長的活性物質(zhì)，提高植物固氮性能，促進(jìn)植物對惡劣環(huán)境的適應(yīng)，加強(qiáng)系統(tǒng)的生態(tài)平衡，保障寄主植物健康生長。因此本文就近年來甘草有益微生物的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期對提高栽培甘草的質(zhì)量有指導(dǎo)意義。

1甘草內(nèi)生菌的研究現(xiàn)狀

內(nèi)生菌是指一生或至少一生中的某個階段能進(jìn)入活體植物組織內(nèi)，并且不引起明顯組織變化的真菌或細(xì)菌［1,2］。1993年，Strobel等［3］從短葉紅豆杉TaxusbrevifoliaNutt的樹皮中分離出二百多種微生物，其中有一株內(nèi)生真菌Taxomycesandreanae能產(chǎn)生紫杉醇，這一研究結(jié)果引起學(xué)者對內(nèi)生菌的廣泛興趣。目前，人們已經(jīng)從長春花、千層塔、銀杏、厚樸等多種植物中分離得到了內(nèi)生菌，并取得了一些成果。

有學(xué)者對甘草內(nèi)生菌也進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)內(nèi)生菌對甘草產(chǎn)生一系列作用。宋素琴等［4］對采自新疆的健康野生脹果甘草不同組織中的內(nèi)生菌進(jìn)行分離，并純化得到149株細(xì)菌和2株真菌，鑒定得出149株細(xì)菌分屬于13個屬，2株真菌分屬于青霉菌屬Penicillium和鐮刀菌屬Fusarium。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)內(nèi)生菌可通過拮抗病原菌促進(jìn)甘草生長。饒小莉等［5］從烏拉爾甘草健康植株的根莖葉中共分離到內(nèi)生細(xì)菌98株，并采用平板對峙方法篩選出6株菌株，其對植物病原菌有明顯體外拮抗活性，鑒定這6株拮抗菌株分屬萎縮芽孢桿菌(Bacillusatrophaeus)、多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、Paenibacillusehimensis。龔明福等［6］采用無菌操作技術(shù)從野生健康甘草Glycyrrhizauralensis的根、莖、葉、種子、根瘤等組織中分離出內(nèi)生細(xì)菌（Endophyticbacteria)125株，其中31株對棉花枯萎病菌(Fusariumoxysporum)、棉花黃萎病菌(Verticilliumdahliae)具有較強(qiáng)的拮抗活性，這31株內(nèi)生細(xì)菌分屬于氣芽孢桿菌屬(Aerobacillussp.)、氣單胞菌屬(Aeromonassp.)、芽孢桿菌屬(Bacillussp.)、黃單孢桿菌屬(Xanthomonassp.)、假單胞桿菌屬(Pseudomonassp.)、土壤桿菌屬(Agrobacteriumsp.)。另有研究發(fā)現(xiàn)，從甘草中分離的有些內(nèi)生菌還可產(chǎn)生活性物質(zhì)。韋革宏等［7］從烏拉爾甘草和光果甘草中共分離得到68株內(nèi)生菌，從中篩選出一個來自烏拉爾甘草的菌株Mesorhizobiumsp.CCNWGX022，從該菌株發(fā)酵液的石油醚提取物中分離得到了十八烷酸內(nèi)酯Rhizobialide，是及時次從內(nèi)生菌中得到此類物質(zhì)。另有學(xué)者研究了內(nèi)生菌在甘草不同部位及不同月份的數(shù)量變化趨勢。林世利等［8］分離出不同月份苦豆子、駱駝刺、苜蓿、鈴鐺刺、甘草不同部位的內(nèi)生細(xì)菌，研究阿拉爾地區(qū)豆科植物內(nèi)生細(xì)菌種群動態(tài)。結(jié)果顯示5月份的苦豆子和甘草植株、8月份的苜蓿植株、9月份的鈴鐺刺和駱駝刺植株的內(nèi)生細(xì)菌的種類最多。內(nèi)生細(xì)菌種類的分布規(guī)律依次為苦豆子中葉＞莖＞根＞種子＞花，苜蓿中根＞葉＞莖＞花＞種子，鈴鐺刺中莖＞葉＞種子＞花＞根，駱駝刺中根＞莖≥葉＞種子＞花，甘草中莖＞根＞葉＞種子＞花。5種豆科植物生長期中總帶菌量平均值在各個月份變化趨勢不同，并且各個月份的帶菌量處于交替變化之中，說明不同月份5種豆科植物內(nèi)生細(xì)菌的種類和數(shù)量不同，同種豆科植物不同組織部位的內(nèi)生細(xì)菌的種類和數(shù)量有差異。

2甘草根瘤菌的研究現(xiàn)狀

根瘤菌是與豆科植物共生，形成根瘤并固定空氣中的氮?dú)夤┲参餇I養(yǎng)的一類桿狀細(xì)菌。這種共生體系具有很強(qiáng)的固氮能力。根瘤菌分快生和慢生兩種類型，為化能異養(yǎng)菌。目前有學(xué)者已經(jīng)從甘草中分離得到根瘤菌并進(jìn)行了一些相關(guān)研究。

目前對甘草根瘤菌的研究多體現(xiàn)在根瘤菌的分類上。楊雪穎等［9］通過對西北干旱半干旱地區(qū)68株甘草根瘤菌的表型多樣性和抗逆性分離研究，發(fā)現(xiàn)1個新類群和1個具有較高抗逆性的菌株。對新類群的中心菌株CCNWGX022和高抗性菌株CCNWGX035進(jìn)行16SrDNA全序列測定及系統(tǒng)進(jìn)化研究。結(jié)果表明，CCNWGX022和CCNWGX035與中慢生根瘤菌屬內(nèi)參比菌株的16SrDNA相似性分別大于96.8％和98.3％，判定它們均屬于中慢生根瘤菌屬。谷峻等［10］采用表型數(shù)值分類、16SrDNAPCR-RFLP分析和BOX-PCR指紋圖譜分析的方法對中國北方地區(qū)的甘草根瘤菌進(jìn)行表型、遺傳多樣性分析。供試菌株在數(shù)值分類聚類分析中約85％的相似水平上產(chǎn)生2個表觀群，有11株菌未與已知參比菌株聚群。16SrDNAPCR-RFLP分析表明，供試的20株菌共產(chǎn)生14種遺傳型，表現(xiàn)出豐富的遺傳多樣性。BOX-PCR指紋圖譜分析進(jìn)一步證明與甘草共生的根瘤菌的基因組也具有多樣性。由此得出結(jié)論：在中國北方地區(qū)與甘草共生的根瘤菌在Sinorhizobium、Rhizobium和Mesorhizobium屬中均有分布。

3甘草菌根真菌的研究現(xiàn)狀

菌根是土壤中某些真菌與植物根的共生體。凡能引起植物形成菌根的真菌稱為菌根真菌，大部分屬擔(dān)子菌亞門，小部分屬子囊菌亞門。菌根真菌與植物之間建立相互有利、互為條件的生理整體，并各有形態(tài)特征，這是真核生物之間實(shí)現(xiàn)共生關(guān)系的典型代表。根據(jù)形態(tài)和解剖學(xué)的特征，又把菌根分為外生菌根和內(nèi)生菌根兩大類。有學(xué)者對甘草菌根真菌進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)菌根真菌可促進(jìn)甘草的生長。饒小莉等［11］分離了甘草的VA菌根，并用三葉草進(jìn)行單孢繁殖，將繁殖后的菌根真菌回接甘草，結(jié)果發(fā)現(xiàn)接種了菌根真菌的甘草植株筆長、根粗、莖葉干重和根干重都有較大程度的提高，均比對照顯著增加，并且不同處理對植株生長影響不同，得出結(jié)論接種VA菌根真菌顯著促進(jìn)了甘草的營養(yǎng)生長。JingnanLiu等［12］用兩種AM菌根真菌Glomusmosseae與Glomusversiforme接種甘草，結(jié)果顯示接種的甘草相對于對照組在生長的早期和晚期有顯著提高，葉攝取磷的量比對照組多，并且根中甘草酸的濃度有所升高，但根部氧化酶活性相對降低了，由此得出結(jié)論接種AM菌根真菌有可能成為提高甘草藥用價(jià)值的有效途徑。

4甘草其他微生物學(xué)相關(guān)研究現(xiàn)狀

近年來，對甘草微生物學(xué)轉(zhuǎn)化等方面的研究工作也取得了一定成果。謝毛成［13］利用發(fā)根農(nóng)桿菌的Ri質(zhì)粒，以光果甘草種子胚萌發(fā)形成的實(shí)生苗不同部位為外植體，成功誘導(dǎo)出光果甘草毛狀根，并利用TLDNA中rolC序列中的特異性引物，應(yīng)用PCR技術(shù)對光果甘草毛狀根進(jìn)行了分子水平的鑒定，并利用理化手段對毛狀根轉(zhuǎn)化后產(chǎn)生的冠瘦堿進(jìn)行了薄層定性鑒定，從不同水平上證實(shí)了光果甘草毛狀根核基因組中已整合了外源Ri質(zhì)粒的T-DN段。燕飛等［14］利用發(fā)根農(nóng)桿菌R1601對藥用植物脹果甘草(GlycyrrhizainflatBat)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，誘導(dǎo)其產(chǎn)生發(fā)根。在發(fā)根誘導(dǎo)過程中，分別用不同菌液濃度、不同浸染時間對脹果甘草子葉、胚軸進(jìn)行轉(zhuǎn)化處理，統(tǒng)計(jì)、比較各條件下的發(fā)根率，結(jié)果表明，用稀釋2倍的菌液浸染子葉8min時，發(fā)根誘導(dǎo)率較高,為56.49%。何晨等［15］用一株產(chǎn)β-葡糖醛酸酶的菌種HC-12對甘草進(jìn)行液體發(fā)酵轉(zhuǎn)化。通過對菌種復(fù)合誘變以及應(yīng)用系統(tǒng)數(shù)值化及靈敏值系統(tǒng)調(diào)控技術(shù)優(yōu)化了發(fā)酵工藝，把甘草中不足0.1%的甘草次酸的含量提高了20倍以上。經(jīng)過柱層析及HPLC及1HNMR鑒定分離得到了甘草次酸純品，并通過動物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了發(fā)酵甘草于未發(fā)酵的生品對照甘草具有抗炎活性和鎮(zhèn)痛作用顯著性效果。

5小結(jié)

內(nèi)生菌對甘草的有益作用體現(xiàn)在：①內(nèi)生菌有促進(jìn)甘草生長作用，內(nèi)生菌可與病原菌競爭營養(yǎng)或直接產(chǎn)生拮抗物質(zhì)而抑制病原菌，從而促進(jìn)甘草生長。②有些內(nèi)生菌可產(chǎn)生活性物質(zhì)。③內(nèi)生菌在甘草不同部位及不同月份的數(shù)量呈現(xiàn)一定的變化趨勢。另有研究表明，內(nèi)生菌能產(chǎn)生與宿主相同的活性物質(zhì)［3］，王興紅［16］推測內(nèi)生真菌可能與中藥的道地性有密切的關(guān)系。這些成果對于甘草內(nèi)生菌的研究有重要意義。

根瘤菌對甘草的有益作用體現(xiàn)在：根瘤菌能夠通過與甘草共生，引起甘草根部或莖部結(jié)瘤，將空氣中的N2轉(zhuǎn)化為可吸收利用的NH4，從而為甘草提供氮素營養(yǎng)，促進(jìn)其生長。

菌根真菌對甘草的有益作用體現(xiàn)在：甘草和菌根真菌是一種互惠共生的關(guān)系，它們之間可以交換各自所需的物質(zhì)，甘草借助菌根真菌吸收水分、養(yǎng)分和生長促進(jìn)劑，而菌根真菌也從甘草中攝取自身生長所需要的糖分和其它有機(jī)物。菌根真菌是根系的延長和擴(kuò)展，且比根系吸收水分、養(yǎng)分的能力大得多，可促進(jìn)甘草的營養(yǎng)生長，提高甘草的藥用價(jià)值。

微生物轉(zhuǎn)化對甘草的作用體現(xiàn)在：對甘草進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化，可提高其有效成分含量，用藥效果可得到提高。

總之，微生物是個潛力巨大、尚待開發(fā)的資源，對甘草相關(guān)微生物進(jìn)行研究有重大意義，有利于提高甘草的質(zhì)量，對于中藥的可持續(xù)發(fā)展也將起到重大作用。

微生物論文:醫(yī)學(xué)微生物學(xué)臨床的醫(yī)學(xué)論文

“興趣是好的老師”。在教學(xué)中,教師如何激發(fā)學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣,培養(yǎng)其對醫(yī)學(xué)微生物學(xué)的興趣和熱愛,是學(xué)好醫(yī)學(xué)微生物學(xué)的動力源泉。在對教學(xué)工作的不斷探索和改革中我們發(fā)現(xiàn),首次的緒論課會給學(xué)生帶來先入為主的影響,關(guān)系到學(xué)生對教師及課程的評價(jià),直接影響學(xué)生對課程的學(xué)習(xí)積極性和主觀能動性。通過緒論課可以啟發(fā)學(xué)生的學(xué)習(xí)動機(jī),激發(fā)他們的學(xué)習(xí)興趣。同時,在緒論課上可以設(shè)置一些問題(如人體自身腸道中的微生物與機(jī)體組織之間存在怎樣的相互作用?微生物的耐藥性是怎么產(chǎn)生的,我們應(yīng)該怎樣解決耐藥現(xiàn)象日益嚴(yán)重這一問題?曾經(jīng)一度被控制的傳染病又開始死灰復(fù)燃,原因是什么,我們應(yīng)該如何應(yīng)對?),在后續(xù)的授課過程中逐漸揭開謎底。這樣帶著問題開展學(xué)習(xí),可以較好地啟發(fā)學(xué)生的學(xué)習(xí)積極性,讓學(xué)生主動開啟微生物知識的大門。近年來由病原微生物引起的傳染病嚴(yán)重威脅著人類的健康,大量的新聞報(bào)道使學(xué)生對這些病原微生物有了一些粗淺的認(rèn)識,將這些內(nèi)容加入課堂教學(xué)內(nèi)容中不僅可以增強(qiáng)學(xué)生學(xué)習(xí)的興趣,使內(nèi)容變得更加生動,而且使學(xué)生充分認(rèn)識到微生物原來距離我們?nèi)绱酥?使理論知識找到實(shí)際落腳點(diǎn)。比如2010年8月,美國雞蛋因受沙門氏菌污染從而導(dǎo)致至少1300人受到沙門氏菌的感染。2011年,德國下薩克森州的豆芽被腸出血性大腸桿菌EHEC污染,從而造成22人因生食豆芽死亡,2200人住院治療。此外,還有近來流行的H7N9病毒、埃博拉病毒等。我們通過這些公共衛(wèi)生事件的引入,講解相關(guān)病原微生物的生物學(xué)性狀、致病性及免疫性、微生物學(xué)檢查法及防治原則,使學(xué)生有強(qiáng)烈的探索欲望,有效提高了課堂學(xué)習(xí)效率。

2靈活多樣,結(jié)合臨床,增強(qiáng)學(xué)生的主觀能動性

教學(xué)方法的選擇應(yīng)根據(jù)不同的認(rèn)知對象、不同的學(xué)科、同一學(xué)科的不同內(nèi)容從而選擇不同的方法,但不管采取何種教學(xué)方法,關(guān)鍵在于把課上活,充分調(diào)動學(xué)生參與教學(xué)的積極性。因而根據(jù)教學(xué)內(nèi)容的不同,我們采取了多種教學(xué)方法。如對于細(xì)菌的形態(tài)和結(jié)構(gòu)這一章節(jié)內(nèi)容,采用直觀的多媒體教學(xué)可以讓學(xué)生形象地看到各種細(xì)菌的形態(tài)、基本結(jié)構(gòu)及特殊結(jié)構(gòu);在細(xì)菌各論部分,選取部分教學(xué)單元由學(xué)生自主教學(xué)。教師事先根據(jù)教學(xué)目的、教學(xué)內(nèi)容提出授課提綱、學(xué)習(xí)重點(diǎn)及難點(diǎn)并確定人員分組。小組成員細(xì)致分工、相互協(xié)作,在課后完成資料素材收集及教學(xué)課件的準(zhǔn)備。在此期間,教師與學(xué)生進(jìn)行充分溝通,及時為學(xué)生排疑解惑,引導(dǎo)學(xué)生在教學(xué)大綱的框架下安排課堂講授內(nèi)容,并傳授講課技巧及注意事項(xiàng)。同時設(shè)計(jì)《學(xué)生自主學(xué)習(xí)實(shí)踐評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)》,由學(xué)生從教學(xué)內(nèi)容安排、課件制作、語言表達(dá)等多方面互相進(jìn)行評議、分析和總結(jié),教師進(jìn)行點(diǎn)評總結(jié)。這種教學(xué)方式一方面活躍了課堂氣氛,加深學(xué)生對所學(xué)知識的理解,增強(qiáng)了學(xué)生的團(tuán)隊(duì)意識,另一方面也可以讓教師在與學(xué)生的互動中、從學(xué)生獨(dú)特的視角中發(fā)現(xiàn)許多平時不會思索的問題;在學(xué)習(xí)引起人類疾病的常見病毒這一部分內(nèi)容時,采取專題討論方式進(jìn)行學(xué)習(xí)。專題討論式學(xué)習(xí)由教師提出專題,分組學(xué)生在本專題內(nèi)提出應(yīng)深入討論的問題,查資料,作綜述,課堂進(jìn)行討論。例如“人類免疫缺陷病毒”的討論式教學(xué),學(xué)生提出一系列問題,如HIV-1感染的分子機(jī)制及免疫反應(yīng)、T細(xì)胞功能受損的疾病、HIV疫苗的研究等,經(jīng)過討論,不僅完成了教學(xué)內(nèi)容,而且為學(xué)生提供了一次“綜述訓(xùn)練”的機(jī)會,教學(xué)效果令人滿意。此外,作為一門與臨床學(xué)科關(guān)系十分緊密的基礎(chǔ)課程,我們在教學(xué)過程中十分注重微生物學(xué)知識的臨床應(yīng)用,采用PBL教學(xué)法將臨床病例分析引入課堂討論教學(xué),由病引入菌,菌中解析病,菌病結(jié)合,解除病菌。如此,在整個講授過程中就將病原微生物的生物學(xué)特性、致病物質(zhì)與致病機(jī)制、檢查及防治原則講解清楚。

3反映前沿,開闊視野,培養(yǎng)學(xué)生創(chuàng)新能力

在教學(xué)過程中,既要將教材中最基本、最核心的理論知識傳授給學(xué)生,為學(xué)生自主學(xué)習(xí)打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ),同時要補(bǔ)充一些開拓性、時代性和應(yīng)用性較強(qiáng)的學(xué)科前沿內(nèi)容。如微生物的耐藥性這一章節(jié),我們?yōu)閷W(xué)生播放與耐藥機(jī)制相關(guān)的視頻和短片,引導(dǎo)學(xué)生就微生物耐藥機(jī)制的產(chǎn)生及防控進(jìn)行積極的討論,鼓勵學(xué)生查閱耐藥機(jī)制近期的高質(zhì)量學(xué)術(shù)論文并就學(xué)習(xí)心得進(jìn)行討論交流,取得了良好的效果。此外,在授課過程中結(jié)合教研室老師的科研方向,為學(xué)生講授該領(lǐng)域的研究進(jìn)展,如人體微生態(tài)學(xué)與免疫性疾病的相關(guān)性研究進(jìn)展、新出現(xiàn)的傳染病病原體、流行性感冒病毒的研究進(jìn)展等教材中鮮有介紹的前沿動態(tài),從而啟迪學(xué)生思維,拓寬學(xué)生的知識面。同時鼓勵學(xué)生積極參與教師的科研課題,通過進(jìn)行科學(xué)實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)一步激發(fā)學(xué)生學(xué)習(xí)微生物學(xué)的興趣及愛好,培養(yǎng)學(xué)生發(fā)現(xiàn)問題、解決問題的能力和創(chuàng)新能力,提高學(xué)生綜合素質(zhì)。

4利用網(wǎng)絡(luò),練習(xí)鞏固,搭建師生交流的良好平臺

我校于2006年底引入Blackboard教學(xué)教育平臺,以整合學(xué)校所在的杭州濱江高教園區(qū)知識管理系統(tǒng)為載體,在園區(qū)師生中普及終身學(xué)習(xí)的觀念;培養(yǎng)學(xué)生自主學(xué)習(xí)、探究性學(xué)習(xí)和協(xié)作學(xué)習(xí)的方法;改變教師的教學(xué)觀念和教學(xué)方法,強(qiáng)化師生交流互動,調(diào)動學(xué)生參與、協(xié)商教學(xué)改革,不斷改善師生的教學(xué)關(guān)系;引導(dǎo)、鼓勵品質(zhì)教學(xué)資源的共建共享,提高師生教學(xué)資源與占有水平,實(shí)現(xiàn)教育資源的拓展。本教研室針對五年制學(xué)生基礎(chǔ)較好、學(xué)習(xí)能動性較高的特點(diǎn),讓學(xué)生利用Bb平臺以及互聯(lián)網(wǎng)其他資源,結(jié)合案例式教學(xué),對醫(yī)學(xué)微生物學(xué)課程教學(xué)模式進(jìn)行改革。以問題為基礎(chǔ),讓學(xué)生處于一個將來知識被應(yīng)用時相似的環(huán)境中,促進(jìn)學(xué)生從不同角度思考問題的能力、加強(qiáng)自我指導(dǎo)性學(xué)習(xí)、問題解決技巧等能力,充分激發(fā)了學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣及積極性。同時,教研室利用Excel表格建立課程選擇題題庫,用Excel函 數(shù)與宏語言構(gòu)建選擇題練習(xí)程序。機(jī)組選項(xiàng)題的選項(xiàng)由程序根據(jù)知識庫計(jì)算組合而成,實(shí)現(xiàn)考查內(nèi)容的“72變化”,有利于考查學(xué)生對特定具體學(xué)科問題的掌握能力,并防止了考試對知識的簡單再現(xiàn),以及學(xué)生對知識的死記硬背。這種題型設(shè)計(jì)靈活,考核的內(nèi)容源于大綱、教材,但又不拘泥于大綱和教材,擺脫了教材文字的束縛,更有利于考查學(xué)生的學(xué)科綜合能力。在此基礎(chǔ)上我們將選擇題練習(xí)程序改進(jìn)成可利用計(jì)算機(jī)局域網(wǎng)進(jìn)行課程選擇題的練習(xí)系統(tǒng),并在教學(xué)實(shí)踐中得以應(yīng)用。選擇題庫設(shè)計(jì)成游戲模式,根據(jù)獲得的分?jǐn)?shù)和難度進(jìn)級,極大地刺激了學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣,寓教于樂。我們將攻關(guān)練習(xí)題庫分割成五級:1級0-20分;2級21-40分;3級41-70分;4級71-90分;5級91-100分,可將此部分內(nèi)容作為平時成績的一部分,計(jì)入的考核成績。我們在醫(yī)學(xué)微生物學(xué)教學(xué)過程中,一直遵循“學(xué)生是教學(xué)主體”,并始終貫穿“互動”的教學(xué)理論。為了培養(yǎng)高素質(zhì)人才,在教學(xué)中我們還需要繼續(xù)探索合適的教學(xué)方法及教學(xué)模式,學(xué)習(xí)國內(nèi)外先進(jìn)的教學(xué)理念及教學(xué)方法,注重知識更新,緊跟學(xué)科發(fā)展的步伐,通過不斷的學(xué)習(xí)進(jìn)一步提高教師自身的綜合素質(zhì),這樣才能更好地指導(dǎo)學(xué)生探索微生物世界的奧秘。

微生物論文:中醫(yī)學(xué)專業(yè)微生物及免疫學(xué)教學(xué)體會

微生物及免疫學(xué)屬于醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)課,具有名詞多、描述多、概念抽象、難記憶、難理解等教學(xué)特點(diǎn),理論相對枯燥,實(shí)踐性不強(qiáng),是醫(yī)學(xué)院校學(xué)生普遍感到難學(xué)的課程[1],對于文科生占大多數(shù)的中醫(yī)專業(yè)學(xué)生來說就更是難上加難,在學(xué)習(xí)過程中,學(xué)生對過難、過深的東西都不會感興趣。因此結(jié)合中醫(yī)專業(yè)學(xué)生的特點(diǎn),進(jìn)行教學(xué)方法的改進(jìn),來提高他們學(xué)習(xí)這門課程興趣和主動性。

中醫(yī)專業(yè)的學(xué)生特點(diǎn)是學(xué)生家庭以從事醫(yī)務(wù)和知識分子為主,尤以中醫(yī)名家子弟較為突出;而生源結(jié)構(gòu)中以城市、文科及女生人數(shù)相對偏多[2]。據(jù)統(tǒng)計(jì)我校中醫(yī)專業(yè)文科生能占75%,而女生人數(shù)可以達(dá)到70%。針對中醫(yī)專業(yè)學(xué)生的特點(diǎn),在微生物及免疫學(xué)教學(xué)過程中進(jìn)行教學(xué)方法的改革來提高教學(xué)效果。

1.找到兩者共同點(diǎn)—類比(利用優(yōu)勢攻克難點(diǎn))

醫(yī)學(xué)院校招文科生多,主要是因?yàn)橹嗅t(yī)學(xué)在其長期的發(fā)展中受到了古代哲學(xué)的深刻影響。中醫(yī)藥及相關(guān)專業(yè)學(xué)科具有特殊的人文哲學(xué)屬性[3]。其吸收了古代盛行的哲學(xué)思想如精氣、陰陽、五行等,并以這些理論為基礎(chǔ),構(gòu)建自己獨(dú)特的理論體系,是古代多學(xué)科交互滲透的產(chǎn)物[4]。所以可以看出中醫(yī)學(xué)理論是在中國的歷史文化背景下的蘊(yùn)育而出的。而文科生文史知識豐富、善于閱讀、思維活躍,考慮這方面因素,文科生能夠比較好的理解中醫(yī)理論。這是文科生的優(yōu)勢。并且中醫(yī)的基礎(chǔ)理論在大一就已經(jīng)學(xué)過了,包括醫(yī)古文、中藥、方劑等課程已經(jīng)學(xué)過,中醫(yī)對他們的熏陶已經(jīng)使學(xué)生對其很認(rèn)可了,所以利用他們已知的和熟悉的知識理論來類比性的介紹新的知識,理解起來較為容易一些。

例如中醫(yī)理論是建立在陰陽五行這種樸素的哲學(xué)理念上的,中醫(yī)講究的是陰陽平衡(包括人體內(nèi)部和環(huán)境),而微生物及免疫學(xué)實(shí)際上也講究平衡,講究病原微生物與人體免疫系統(tǒng)的平衡,以及病原微生物之間及外界環(huán)境之間的平衡。這一點(diǎn)使他們的最基本的共同點(diǎn)。所以在講課時把微免的這些平衡與中醫(yī)的陰陽平衡進(jìn)行類比的方式進(jìn)行講授,受到學(xué)生的認(rèn)可。在講消毒和滅菌的這一章時可以強(qiáng)調(diào)對于病原微生物與我們?nèi)祟惒⒉皇悄闼牢一畹臓顟B(tài),而是我們也要與它們保持平衡,因此在不同的時期,根據(jù)不同的目的,我們是要采取不同的消毒滅菌的方式是來保持這種平衡,而并不是一味的殺死病原微生物。緊接著舉一些例子來證明。例如我們生病了,進(jìn)行輸液時,這個注射用的生理鹽水一定是無菌的,因?yàn)樯睇}水是要進(jìn)入我們的血循環(huán)中的,血循環(huán)是沒有任何細(xì)菌的,為了不破壞這樣的平衡,我們注入血循環(huán)中的任何藥物都必須是無菌的。但是對于人體的有些部位,例如女性的陰道,本身就有大量的細(xì)菌,是以乳酸桿菌為主,有些女性經(jīng)常沖洗陰道,破壞了陰道本身的平衡,反而容易得陰道炎。就這些生活中生動的例子可以讓學(xué)生感受到人體的這種微生態(tài)的平衡與中醫(yī)上講陰陽平衡很相似,無論哪種平衡被破壞都會引起疾病,這樣理解起來也就不困難了。在微生物及免疫學(xué)的整個授課過程中不時的去穿插一些學(xué)生熟知的中醫(yī)理論知識,可以進(jìn)行類比。微免課程探討的就是病原微生物與人體免疫系統(tǒng)的相互作用,其相互作用的最終是——平衡或不平衡。這要求教師大概了解中醫(yī)理論的知識。

2.在緒論中介紹背景知識

中醫(yī)專業(yè)學(xué)生因?yàn)闆]有相關(guān)學(xué)科的背景知識,有相當(dāng)一部分學(xué)生反映上課聽不懂。即認(rèn)知結(jié)構(gòu)中沒有適當(dāng)?shù)钠痨柟套饔玫闹R觀念可利用,阻礙了新的學(xué)習(xí)與保持,因此提供背景信息及相關(guān)的概念將有助于啟動他們的學(xué)習(xí)[5]。例如在課堂上加入一些本學(xué)科的背景知識教學(xué)效果較好。對于大多數(shù)是文科生的中醫(yī)專業(yè)學(xué)生來說,他們的想像力是十分豐富的,需要教師去組織語言,可以通過這幾點(diǎn)來將微免的發(fā)展簡史講的生動而具體:人類在沒有發(fā)現(xiàn)微生物時對疾病的看法,以及人類是怎樣發(fā)現(xiàn)微生物的,以及是怎樣把它和疾病聯(lián)系到一起的,是怎樣來尋找預(yù)防和治療的方法。做好這一點(diǎn),對于提高學(xué)生學(xué)習(xí)本門課程有很大的幫助。

3.增加內(nèi)容的趣味性

在授課過程中,可以用一些小故事、圖片、視屏、生活(增加與原有知識相關(guān)性)等各種方式來提高課程內(nèi)容的趣味性。偉大的科學(xué)家愛因斯坦說過:“興趣是好的老師”。 興趣是學(xué)生學(xué)習(xí)的動力和加速劑,是一切創(chuàng)新動力的重要源泉,是學(xué)生掌握知識,發(fā)展智力,形成創(chuàng)新能力的內(nèi)在動力[6]。例如介紹培養(yǎng)基時,可以將科赫發(fā)明培養(yǎng)基的過程較詳細(xì)的講給學(xué)生,不單單增強(qiáng)內(nèi)容的趣味性,而且在這些發(fā)明的過程中滲透了很多科學(xué)家的的科學(xué)素質(zhì)和道德品質(zhì),無形中對學(xué)生的科學(xué)素質(zhì)和道德品質(zhì)有了一定的影響。課堂上還可以應(yīng)用多媒體播放一些相關(guān)視屏,例如在講到流感病毒時,播放了一個《流行感冒的發(fā)病過程》的視屏,受到學(xué)生的歡迎,因?yàn)樵谝暺林胁《静辉偈强床灰娒坏降?甚至在免疫學(xué)中的免疫細(xì)胞也是栩栩如生的,是學(xué)生有耳目一新的感覺,甚至突然對微免學(xué)茅塞頓開感悟。在上的每一次課中去花一些心思來設(shè)計(jì)好每一次課的引課,也是可以較好的提高學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣。中醫(yī)專業(yè)學(xué)生條理性的思維可能比理科學(xué)生占多數(shù)的一些專業(yè)的學(xué)生稍遜色,但發(fā)散性的思維較好,介紹課程中的與人文科學(xué)相關(guān)的內(nèi)容,用一些有趣的、能打動學(xué)生的歷史過程,喚起學(xué)生的求知欲效果較好。

4.介紹書籍網(wǎng)站

閱讀是人類社會中不可缺少的一種認(rèn)知活動, 是人類汲取知識的重要手段和認(rèn)識周圍世界的途徑之一, 是學(xué)習(xí)所有學(xué)科的基礎(chǔ)[7]。文科生較多的中醫(yī)專業(yè)學(xué)生的閱讀能力較強(qiáng),可以通過介紹與之相關(guān)的有趣的的內(nèi)容來開闊學(xué)生的視野。可以向?qū)W生介紹相關(guān)課外書籍和網(wǎng)站。這樣做可以使學(xué)生的視野開闊,相當(dāng)于本課程是一個原點(diǎn),以這個原點(diǎn)向外發(fā)散出去,了解了相關(guān)內(nèi)容,再回到原點(diǎn),則感覺課本中的內(nèi)容并不是難以理解和枯燥,這樣學(xué)生就會覺得學(xué)這門課程很輕松。

綜上說述,結(jié)合中醫(yī)專業(yè)學(xué)生特點(diǎn),利用其特點(diǎn)進(jìn)行一些教學(xué)方法的改進(jìn),的確可以讓學(xué)生不再覺得微生物及免疫學(xué)是比較枯燥、抽象和難學(xué)的一門課程。實(shí)際上中醫(yī)學(xué)與微生物及免疫學(xué)都與哲學(xué)有很多聯(lián)系。愛因斯坦這樣談?wù)撜軐W(xué):如果把哲學(xué)理解為在最普遍和最廣泛的形式中對知識的追求,那么,哲學(xué)顯然就可以被認(rèn)為是全部科學(xué)之母學(xué)。在課堂內(nèi)容中加進(jìn)些人文性的(包括哲學(xué),科學(xué),思想、人文素質(zhì)等)知識,有助于提高學(xué)生各方面能力。

微生物論文:微生物常規(guī)鑒定的技術(shù)

一、形態(tài)結(jié)構(gòu)和培養(yǎng)特性觀察

1、微生物的形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察主要是通過染色,在顯微鏡下對其形狀、大小、排列方式、細(xì)胞結(jié)構(gòu)(包括細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞核、鞭毛、芽孢等)及染色特性進(jìn)行觀察,直觀地了解細(xì)菌在形態(tài)結(jié)構(gòu)上特性,根據(jù)不同微生物在形態(tài)結(jié)構(gòu)上的不同達(dá)到區(qū)別、鑒定微生物的目的。

2、細(xì)菌細(xì)胞在固體培養(yǎng)基表面形成的細(xì)胞群體叫菌落(colony)。不同微生物在某種培養(yǎng)基中生長繁殖,所形成的菌落特征有很大差異,而同一種的細(xì)菌在一定條件下,培養(yǎng)特征卻有一定穩(wěn)定性。,以此可以對不同微生物加以區(qū)別鑒定。因此,微生物培養(yǎng)特性的觀察也是微生物檢驗(yàn)鑒別中的一項(xiàng)重要內(nèi)容。

1)細(xì)菌的培養(yǎng)特征包括以下內(nèi)容:在固體培養(yǎng)基上,觀察菌落大小、形態(tài)、顏色(色素是水溶性還是脂溶性)、光澤度、透明度、質(zhì)地、隆起形狀、邊緣特征及遷移性等。在液體培養(yǎng)中的表面生長情況(菌膜、環(huán))混濁度及沉淀等。半固體培養(yǎng)基穿刺接種觀察運(yùn)動、擴(kuò)散情況

2)霉菌酵母菌的培養(yǎng)特征:大多數(shù)酵母菌沒有絲狀體,在固體培養(yǎng)基上形成的菌落和細(xì)菌的很相似,只是比細(xì)菌菌落大且厚。液體培養(yǎng)也和細(xì)菌相似,有均勻生長、沉淀或在液面形成菌膜。霉菌有分支的絲狀體,菌絲粗長,在條件適宜的培養(yǎng)基里,菌絲無限伸長沿培養(yǎng)基表面蔓延。霉菌的基內(nèi)菌絲、氣生菌絲和孢子絲都常帶有不同顏色,因而菌落邊緣和中心,正面和背面顏色常常不同,如青霉菌:孢子青綠色,氣生菌絲無色,基內(nèi)菌絲褐色。霉菌在固體培養(yǎng)表面形成絮狀、絨毛狀和蜘蛛網(wǎng)狀菌落。

二、生理生化試驗(yàn)

微生物生化反應(yīng)是指用化學(xué)反應(yīng)來測定微生物的代謝產(chǎn)物,生化反應(yīng)常用來鑒別一些在形態(tài)和其它方面不易區(qū)別的微生物。因此微生物生化反應(yīng)是微生物分類鑒定中的重要依據(jù)之一。

微生物檢驗(yàn)中常用的生化反應(yīng)有:

1、糖酵解試驗(yàn)

不同微生物分解利用糖類的能力有很大差異,或能利用或不能利用,能利用者,或產(chǎn)氣或不產(chǎn)氣。可用指示劑及發(fā)酵管檢驗(yàn)。

試驗(yàn)方法:以無菌操作,用接種針或環(huán)移取純培養(yǎng)物少許,接種于發(fā)酵液體培養(yǎng)基管,若為半固體培養(yǎng)基,則用接種針作穿刺接種。接種后,置36±1.0°C培養(yǎng),每天觀察結(jié)果,檢視培養(yǎng)基顏色有無改變(產(chǎn)酸),小倒管中有無氣泡,微小氣泡亦為產(chǎn)氣陽性,若為半固體培養(yǎng)基,則檢視沿穿刺線和管壁及管底有無微小氣泡,有時還可看出接種菌有無動力,若有動力、培養(yǎng)物可呈彌散生長。

本試驗(yàn)主要是檢查細(xì)菌對各種糖、醇和糖苷等的發(fā)酵能力,從而進(jìn)行各種細(xì)菌的鑒別,因而每次試驗(yàn),常需同時接種多管。一般常用的指示劑為酚紅、溴甲酚紫,溴百里藍(lán)和An-drade指示劑。

2、淀粉水解試驗(yàn)

某些細(xì)菌可以產(chǎn)生分解淀粉的酶,把淀粉水解為麥芽糖或葡萄糖。淀粉水解后,遇碘不再變藍(lán)色。

試驗(yàn)方法:以18~24h的純培養(yǎng)物,涂布接種于淀粉瓊脂斜面或平板(一個平板可分區(qū)接種,試驗(yàn)數(shù)種培養(yǎng)物)或直接移種于淀粉肉湯中,于36±1°C培養(yǎng)24~48h,或于20°培養(yǎng)5天。然后將碘試劑直接滴浸于培養(yǎng)表面,若為液體培養(yǎng)物,則加數(shù)滴碘試劑于試管中。立即檢視結(jié)果,陽性反應(yīng)(淀粉被分解)為瓊脂培養(yǎng)基呈深藍(lán)色、菌落或培養(yǎng)物周圍出現(xiàn)無色透明環(huán)、或肉湯顏色無變化。陰性反應(yīng)則無透明環(huán)或肉湯呈深藍(lán)色。

淀粉水解系逐步進(jìn)行的過程,因而試驗(yàn)結(jié)果與菌種產(chǎn)生淀粉酶的能力、培養(yǎng)時間,培養(yǎng)基含有淀粉量和pH等均有一定關(guān)系。培養(yǎng)基pH必須為中性或微酸性,以pH7.2最適。淀粉瓊脂平板不宜保存于冰箱,因而以臨用時制備為妥。

3、V-P試驗(yàn)

某些細(xì)菌在葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中能分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸,丙酮酸縮合,脫羧成乙酰甲基甲醇,后者在強(qiáng)堿環(huán)境下,被空氣中氧氧化為二乙酰,二乙酰與蛋白胨中的胍基生成紅色化合物,稱V-P(+)反應(yīng)。

試驗(yàn)方法:

1)O’Meara氏法:將試驗(yàn)菌接種于通用培養(yǎng)基,于36±1°C培養(yǎng)48h,培養(yǎng)液1ml加O’Meara試劑(加有0.3%肌酸Creatine或肌酸酐Creatinine的40%氫氧化鈉水溶液)1ml,搖動試管1~2min,靜置于室溫或36±1°C恒溫箱,若4h內(nèi)不呈現(xiàn)伊紅、即判定為陰性。亦有主張?jiān)?8~50°C水浴放置2h后判定結(jié)果者。

2)Barritt氏法:將試驗(yàn)菌接種于通用培養(yǎng)基,于36±1°C培養(yǎng)4天、培養(yǎng)液2.5ml先加入5°Cα萘酚(2-na-phthol)純酒精溶液0.6ml,再加40%氫氧化鉀水溶液0.2ml,搖動2~5min,陽性菌常立即呈現(xiàn)紅色,若無紅色出現(xiàn),靜置于室溫或36±1°C恒溫箱,如2h內(nèi)仍不顯現(xiàn)紅色、可判定為陰性。

3)快速法:將0.5%肌酸溶液2滴放于小試管中、挑取產(chǎn)酸反應(yīng)的三糖鐵瓊脂斜面培養(yǎng)物一接種環(huán),乳化接種于其中,加入5%α-萘酚3滴,40%氫氧化鈉水溶液2滴,振動后放置5min,判定結(jié)果。不產(chǎn)酸的培養(yǎng)物不能使用。

本試驗(yàn)一般用于腸桿菌科各菌屬的鑒別。在用于芽胞桿菌和葡萄球菌等其它細(xì)菌時,通用培養(yǎng)基中的磷酸鹽可阻礙乙酰甲基醇的產(chǎn)生,故應(yīng)省去或以氯化鈉代替。

4、甲基紅(Methyl Red)試驗(yàn)

腸桿菌科各菌屬都能發(fā)酵葡萄糖,在分解葡萄糖過程中產(chǎn)生丙酮酸,進(jìn)一步分解中,由于糖代謝的途徑不同,可產(chǎn)生乳酸,琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性產(chǎn)物,可使培養(yǎng)基PH值下降至pH4.5以下,使甲基紅指示劑變紅。

試驗(yàn)方法:挑取新的待試純培養(yǎng)物少許,接種于通用培養(yǎng)基,培養(yǎng)于36±1°C或30°C(以30°C較好)3~5天,從第二天起,每日取培養(yǎng)液1ml,加甲基紅指示劑1~2滴,陽性呈鮮紅色,弱陽性呈淡紅色 ,陰性為黃色。迄至發(fā)現(xiàn)陽性或至第5天仍為陰性、即可判定結(jié)果。

甲基紅為酸性指示劑,pH范圍為4.4~6.0,其pK值為5.0。故在pH5.0以下,隨酸度而增強(qiáng)黃色,在pH5.0以上,則隨堿度而增強(qiáng)黃色,在pH5.0或上下接近時,可能變色不夠明顯,此時應(yīng)延長培養(yǎng)時間,重復(fù)試驗(yàn)。

5、靛基質(zhì)(Imdole)試驗(yàn)

某些細(xì)菌能分解蛋白胨中的色氨酸,生成吲哚。吲哚的存在可用顯色反應(yīng)表現(xiàn)出來。吲哚與對二甲基氨基苯醛結(jié)合,形成玫瑰吲哚,為紅色化合物。

試驗(yàn)方法:將待試純培養(yǎng)物小量接種于試驗(yàn)培養(yǎng)基管,于36±1C培養(yǎng)24h時后,取約2ml培養(yǎng)液,加入Kovacs氏試劑2~3滴,輕搖試管,呈紅色為陽性,或先加少量禁藥或二甲苯,搖動試管以提取和濃縮靛基質(zhì),待其浮于培養(yǎng)液表面后,再沿試管壁徐緩加入Kovacs氏試劑數(shù)滴,在接觸面呈紅色,即為陽性。

實(shí)驗(yàn)證明靛基質(zhì)試劑可與17種不的靛基質(zhì)化合物作用而產(chǎn)生陽性反應(yīng),若先用二甲苯或禁藥等進(jìn)行提取,再加試劑,則只有靛基質(zhì)或5-甲基靛基質(zhì)在溶劑中呈現(xiàn)紅色,因而結(jié)果更為。

6、硝酸鹽(Nitrate)還原試驗(yàn)

有些細(xì)菌具有還原硝酸鹽的能力,可將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽、氨或氮?dú)獾取喯跛猁}的存在可用硝酸試劑檢驗(yàn)。

試驗(yàn)方法:臨試前將試劑的A(磺胺酸冰醋酸溶液)和B(α-萘胺乙醇溶液)試液各0.2ml等量混合、取混合試劑約0.1ml、加于液體培養(yǎng)物或瓊脂斜面培養(yǎng)物表面,立即或于10min內(nèi)呈現(xiàn)紅色即為試驗(yàn)陽性,若無紅色出現(xiàn)則為陰性。

用α-萘胺進(jìn)行試驗(yàn)時,陽性紅色消退很快、故加入后應(yīng)立即判定結(jié)果。進(jìn)行試驗(yàn)時必須有未接種的培養(yǎng)基管作為陰性對照。α-萘胺具有致癌性、故使用時應(yīng)加注意。

7、明膠(Gelatin)液化試驗(yàn)

有些細(xì)菌具有明膠酶(亦稱類蛋白水解酶),能將明膠先水解為多肽,又進(jìn)一步水解為氨基酸,失去凝膠性質(zhì)而液化。

試驗(yàn)方法:挑取18~24h待試菌培養(yǎng)物,以較大量穿刺接種于明膠高層約2/3深度或點(diǎn)種于平板培養(yǎng)基。于20~22℃培養(yǎng)7~14天。明膠高層亦可培養(yǎng)于36±1℃。每天

觀察結(jié)果,若因培養(yǎng)溫度高而使明膠本身液化時應(yīng)不加搖動、靜置冰箱中待其凝固后、再觀察其是否被細(xì)菌液化,如確被液化,即為試驗(yàn)陽性。平板試驗(yàn)結(jié)果的觀察為在培養(yǎng)基平板點(diǎn)種的菌落上滴加試劑,若為陽性,10~20min后,菌落周圍應(yīng)出現(xiàn)清晰帶環(huán)。否則為陰性。 8、尿素酶(Urease)試驗(yàn)

有些細(xì)菌能產(chǎn)生尿素酶,將尿素分解、產(chǎn)生2個分子的氨,使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性,酚紅呈粉紅色。尿素酶不是誘導(dǎo)酶,因?yàn)椴徽摰孜锬蛩厥欠翊嬖?細(xì)菌均能合成此酶。其活性最適pH為7.0。

試驗(yàn)方法:挑取18~24h待試菌培養(yǎng)物大量接種于液體培養(yǎng)基管中,搖均,于36±1℃培養(yǎng)10,60和120min,分別觀察結(jié)果。或涂布并穿刺接種于瓊脂斜面,不要到達(dá)底部,留底部作變色對照。培養(yǎng)2,4和24h分別觀察結(jié)果,如陰性應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)至4天,作最終判定,變?yōu)榉奂t色為陽性。

9、氧化酶(Oxidase)試驗(yàn)

氧化酶亦即細(xì)胞色素氧化酶,為細(xì)胞色素呼吸酶系統(tǒng)的終末呼吸酶,氧化酶先使細(xì)胞色素C氧化,然后此氧化型細(xì)胞色素C再使對苯二胺氧化,產(chǎn)生顏色反應(yīng)。

試驗(yàn)方法:在瓊脂斜面培養(yǎng)物上或血瓊脂平板菌落上滴加試劑1~2滴,陽性者Kovacs氏試劑呈粉紅色~深紫色,Ewing氏改進(jìn)試劑呈藍(lán)色。陰性者無顏色改變。應(yīng)在數(shù)分鐘內(nèi)判定試驗(yàn)結(jié)果。

10、硫化氫(H2S)試驗(yàn)

有些細(xì)菌可分解培養(yǎng)基中含硫氨基酸或含硫化合物,而產(chǎn)生硫化氫氣體,硫化氫遇鉛鹽或低鐵鹽可生成黑色沉淀物。

試驗(yàn)方法:在含有硫代硫酸鈉等指示劑的培養(yǎng)基中,沿管壁穿刺接種,于36±1℃培養(yǎng)24~28h,培養(yǎng)基呈黑色為陽性。陰性應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)至6天。也可用醋酸鉛紙條法:將待試菌接種于一般營養(yǎng)肉湯,再將醋酸鉛紙條懸掛于培養(yǎng)基上空,以不會被濺濕為適度;用管塞壓住置36±1℃培養(yǎng)1~6天。紙條變黑為陽性。

11、三糖鐵(TSI)瓊脂試驗(yàn)

試驗(yàn)方法:以接種針挑取待試菌可疑菌落或純培養(yǎng)物,穿刺接種并涂布于斜面,置36±1℃培養(yǎng)18~24h,觀察結(jié)果。

本試驗(yàn)可同時觀察乳糖和蔗糖發(fā)酵產(chǎn)酸或產(chǎn)酸產(chǎn)氣(變黃);產(chǎn)生硫化氫(變黑)。葡萄糖被分解產(chǎn)酸可使斜面先變黃,但因量少,生成的少量酸,因接觸空氣而氧化,加之細(xì)菌利用培養(yǎng)基中含氮物質(zhì),生成堿性產(chǎn)物,故使斜面后來又變紅,底部由于是在厭氧狀態(tài)下,酸類不被氧化,所以仍保持黃色。

12、硫化氫-靛基質(zhì)-動力(SIM)瓊脂試驗(yàn)

試驗(yàn)方法:以接種針挑取菌落或純養(yǎng)物穿刺接種約1/2深度,置36±1℃培養(yǎng)18~24h,觀察結(jié)果。培養(yǎng)物呈現(xiàn)黑色為硫化氫陽性,混濁或沿穿刺線向外生長為有動力,然后加Kovacs氏試劑數(shù)滴于培養(yǎng)表面,靜置10min,若試劑呈紅色為靛基質(zhì)陽性。培養(yǎng)基未接種的下部,可作為對照。

本試驗(yàn)用于腸桿菌科細(xì)菌初步生化篩選,與三糖鐵瓊脂等聯(lián)合使用可顯著提高篩選功效。

三、血清學(xué)試驗(yàn)

血清學(xué)反應(yīng)是指:相應(yīng)的抗原與抗體在體外一定條件下作用,可出現(xiàn)肉眼可見的沉淀、凝集現(xiàn)象。在食品微生物檢驗(yàn)中,常用血清學(xué)反應(yīng)來鑒定分離到的細(xì)菌,以最終確認(rèn)檢測結(jié)果。

血清學(xué)反應(yīng)的一般特點(diǎn):

1)抗原體的結(jié)合具有特異性,當(dāng)有共同抗原體存在時,會出現(xiàn)交叉反應(yīng)。

2)抗原體的結(jié)合是分子表面的結(jié)合,這種結(jié)合雖相當(dāng)穩(wěn)定,但是可逆的。

3) 抗原體的結(jié)合是按一定比例進(jìn)行的,只有比例適當(dāng)時,才能出現(xiàn)可見反應(yīng)。

4)血清學(xué)反應(yīng)大體分為兩個階段進(jìn)行,但其間無嚴(yán)格界限。及時階段為抗原體特異性結(jié)合階段,反應(yīng)速度很快,只需幾秒至幾分鐘反應(yīng)即可完畢,但不出現(xiàn)肉眼可見現(xiàn)象。第二階段為抗原體反應(yīng)的可見階段,表現(xiàn)為凝集、沉淀、補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)等。反應(yīng)速度慢,需幾分、幾十分以至更長時間。而且,在第二階段反應(yīng)中,電解質(zhì)、PH、溫度等環(huán)境因素的變化,都直接影響血清學(xué)反應(yīng)的結(jié)果。

習(xí)慣上將經(jīng)典的血清學(xué)反應(yīng)分三種類別:凝集反應(yīng)、沉淀反應(yīng)和補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)。

1、凝集反應(yīng)

顆粒性抗原(細(xì)菌、紅細(xì)胞等)與相應(yīng)抗體結(jié)合,在電解質(zhì)參與下所形成的肉眼可見的凝集現(xiàn)象,稱為凝集反應(yīng)(Agglutination reaction)。其中的抗原稱為凝集原,抗體稱為凝集素。在該反應(yīng)中,因?yàn)閱挝惑w積抗體量大,做定量實(shí)驗(yàn)時,應(yīng)稀釋抗體。

1)直接凝集反應(yīng)

顆粒性抗原與相應(yīng)抗體直接結(jié)合所出現(xiàn)的反應(yīng),稱為直接凝集反應(yīng)(Direct agglution reaction)。

a.玻片凝集法。是一種常規(guī)的定性試驗(yàn)方法。原理是用已知抗體來檢測未知抗原。常用于鑒定菌種、血型。如將含有痢疾桿菌抗體的血清與待檢菌液各一滴,在玻片上混勻,數(shù)分種后若出現(xiàn)肉眼可見的凝集塊,即陽性反應(yīng),證明該菌是痢疾桿菌。此法快速、簡便,但不能進(jìn)行定量測定。

b.試管凝集法。是一種定量試驗(yàn)方法。多用已知抗原來檢測血清中有無相應(yīng)抗體及其含量。常用于協(xié)助診斷某些傳染病及進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查。如肥達(dá)氏反應(yīng)就是診斷傷寒、付傷寒的試管凝集試驗(yàn)。因?yàn)橐獪y定抗體的含量,故將待檢查的血清用等滲鹽水倍比稀釋成不同濃度,然后加入等量抗原,37℃或56℃,2~4小時觀察,血清較高稀釋度仍有明顯凝集現(xiàn)象的,為該抗血清的凝集效價(jià)。

2)間接凝集反應(yīng)

將可溶性抗原(抗體)先吸附在一種與免疫無關(guān)的,顆粒狀微球表面,然后與相應(yīng)抗體(抗原)作用,在有電解質(zhì)存在的條件下,即可發(fā)生凝集,稱為間接凝集反應(yīng)(Indirect agglutination)。由于載體增大了可溶性抗原的反應(yīng)面積。當(dāng)載體上有少量抗原與抗體結(jié)合。就出現(xiàn)肉眼可見的反應(yīng),敏感性很高。

2、沉淀反應(yīng)

可溶性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合,在有適量電解質(zhì)存在下,經(jīng)過一定時間,形成肉眼可見的沉淀物,稱為沉淀反應(yīng)(Precipitation)。反應(yīng)中的抗原稱為沉淀原,抗體為沉淀素。由于在單位體積內(nèi)抗原量大,為了不使抗原過剩,故應(yīng)稀釋抗原,并以抗原的稀釋度作為沉淀反應(yīng)的效價(jià)。

1)環(huán)狀沉淀反應(yīng):是一種定性試驗(yàn)方法,可用已知抗體檢測未知抗原。將已知抗體注入特制小試管中,然后沿管壁徐徐加入等量抗原,如抗原與抗體對應(yīng),則在兩液界面出現(xiàn)白色的沉淀圓環(huán)。

2)絮狀沉淀反應(yīng):將已知抗原與抗體在試管(如凹玻片)內(nèi)混勻,如抗原抗體對應(yīng),而又二者比例適當(dāng)時,會出現(xiàn)肉眼可見的絮狀沉淀,此為陽性反應(yīng)。

3)瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn):利用可溶性抗原抗體在半固體瓊脂內(nèi)擴(kuò)散,若抗原抗體對應(yīng),且二者比例合適,在其擴(kuò)散的某一部分就會出現(xiàn)白色的沉淀線。每對抗原抗體可形成一條沉淀線。有幾對抗原抗體,就可分別形成幾條沉淀線。瓊脂擴(kuò)散可分為單向擴(kuò)散和雙向擴(kuò)散兩種類型。單向擴(kuò)散是一種定量試驗(yàn)。可用于免疫蛋白含量的測定。而雙向擴(kuò)散多用于定性試驗(yàn)。由于方法簡便易行,常用于測定分析和鑒定復(fù)雜的抗原成分。>

3、補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)

補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)(Complement fixation reaction)是在補(bǔ)體參與下,以綿羊紅細(xì)胞和溶血素作為指示系統(tǒng)的抗原抗體反應(yīng)。補(bǔ)體無特異性,能與任何一組抗原抗體復(fù)合物結(jié)合而引起反應(yīng)。如果補(bǔ)體與綿羊紅細(xì)胞、溶血素的復(fù)合物結(jié)合,就會出現(xiàn)溶血現(xiàn)象,如果與細(xì)菌及相應(yīng)抗體復(fù)合物結(jié)合,就會出現(xiàn)溶菌現(xiàn)象。因此,整個試驗(yàn)需要有補(bǔ)體、待檢系統(tǒng)(已知抗體或抗原、未知抗原或抗體)及指示系統(tǒng)(綿羊細(xì)胞和溶血素)五種成份參加。其試驗(yàn)原理是補(bǔ)體不單獨(dú)和抗原或抗體結(jié)合。如果出現(xiàn)溶菌,是補(bǔ)體與待檢系統(tǒng)結(jié)合的結(jié)果,說明抗原抗體是相對應(yīng)的,如果出現(xiàn)溶血,說明抗原抗體不相對應(yīng)。此反應(yīng)操作復(fù)雜,敏感性高,特異性強(qiáng),能測出少量抗原和抗體,所以應(yīng)用范圍較廣。

微生物論文:根際微生物群落與促生菌多樣性及其篩選的理論綜述

1904年,德國農(nóng)學(xué)家Hiltner發(fā)現(xiàn)豆科植物根附近區(qū)域的土壤微生物,由于受到根系分泌有機(jī)物質(zhì)對其產(chǎn)生的“效應(yīng)”,表現(xiàn)出相對更高活性的現(xiàn)象,并首次提出“根際”(Rhizosphere)這一概念[1]。現(xiàn)在我們知道,這種“效應(yīng)”其實(shí)是根際微生態(tài)系統(tǒng)中的根際效應(yīng)。單棵植物根際范圍雖小,但放眼看,根際卻是地球上較大的生態(tài)系統(tǒng),其能量流也極其巨大,因而,根際在生物圈功能中的作用非常顯著。曾有研究人員估算,植物20%~50%的光合產(chǎn)物是通過根部釋放出來的[2,3]。

根際土壤中存在大量的宏觀生物和微生物,如細(xì)菌、真菌、原生動物和藻類生物等,細(xì)菌是該群體中數(shù)量最多的一類微生物。微生物和植物在根際環(huán)境中形成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)式關(guān)系會直接和間接地影響植物生長;反過來,植物通過分泌有機(jī)物,構(gòu)建起一個有選擇性的環(huán)境條件,以利于對其生長有益的細(xì)菌,導(dǎo)致根際細(xì)菌多樣性偏低[4,5]。植物根際促生菌(Plant growth-promoting rhizobacteria,PGPR)在根際微生物群體中研究最為熱門,也是對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有應(yīng)用價(jià)值的一類微生物。由于PGPR數(shù)量眾多,且在根際定殖時具有競爭力,加之其作用機(jī)制的多樣性,因此能在很大程度上影響植物生長。然而,人們在使用PGPR或相關(guān)制劑時,普遍發(fā)現(xiàn)大田應(yīng)用效果遠(yuǎn)不及盆栽或溫室條件下的效果理想,主要原因是PGPR對“陌生”環(huán)境的不適應(yīng)。根際微生物是野外環(huán)境中的主要“陌生”因素,因此,了解與某些基本生態(tài)過程,如復(fù)雜性、自然選擇、種間關(guān)系(共生、寄生、共棲和競爭)、演替或擾動效應(yīng)有密切關(guān)系的根際微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性,可以幫助人們更好地理解根際生態(tài)系統(tǒng),并為PGPR的篩選和高效利用提供理論依據(jù)。基于此,本文主要從根際微生物群落多樣性、PGPR生態(tài)和遺傳多樣性以及PGPR的篩選策略等3個方面進(jìn)行綜述。

1 根際微生物群落多樣性

微生物多樣性包括物種、遺傳與變異以及功能多樣性[6]。在根際系統(tǒng)中,細(xì)菌群落的功能多樣性是基于其遺傳變異以及和其他原核、真核生物(如植物)的互作關(guān)系。直至現(xiàn)在,根際微生物多樣性與根際微生物功能之間的關(guān)系仍不十分清楚。根際微生物多樣性信息的缺乏,其原因一是其種類繁多,二是絕大多數(shù)微生物的不可培養(yǎng)性。

1.1 根際微生物群落結(jié)構(gòu)的研究方法

研究微生物群落結(jié)構(gòu),就必須了解各類群微生物群體的種類及數(shù)量。傳統(tǒng)技術(shù)是通過從根際土壤中提取、分離微生物,實(shí)驗(yàn)室條件下對其進(jìn)行形態(tài)學(xué)、生化和遺傳學(xué)檢驗(yàn)。由于細(xì)菌往往和土壤基質(zhì)以及其他細(xì)胞緊密附著,因此在細(xì)菌提取中常用到分散劑,即用物理或化學(xué)方法將細(xì)胞和基質(zhì)區(qū)分開,之后才能對分離細(xì)菌生物量進(jìn)行測定。

微生物生物量的測定常用方法有:顯微鏡下直接計(jì)數(shù)(如吖啶橙染料染色)[7]、微生物呼吸量測定(如基質(zhì)誘導(dǎo)呼吸量,Substrate induced respiration,SIR)[8]、ATP含量測定[9]、較大或然法(Most probable number,MPN)計(jì)數(shù)[10],使用脂類生物標(biāo)志物[11]以及氯仿土壤熏蒸法[12]等。但是,土壤中可培養(yǎng)微生物比例畢竟極低。有研究者曾估算這一比例只有不足1.0%(0.2%~0.8%)[13]。正因?yàn)槿绱?基于平板培養(yǎng)法研究土壤微生物多樣性存在重大缺陷,免培養(yǎng)技術(shù)順應(yīng)而生。所涉及的技術(shù)包括磷脂脂肪酸(Phospholipid fatty acid analysis,PLFA)分析法[14-16]、DNA/RNA雜交[17]、聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase chain reaction,PCR)、核糖體RNA測序[18]、(G+C)含量[19]、溫度梯度凝膠電泳(Temperature gradient gel electrophoresis, TGGE)和變性梯度凝膠電泳(Denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)、限制片段長度多態(tài)性(Restriction fragment length polymorphism,RFLP)[20,21]、DNA微陣列(DNA microarray)[22]技術(shù)(又稱“DNA陣列”或“DNA芯片”)、克隆文庫分析等方法。過去20多年間,人們利用這些技術(shù)手段揭示了很多有關(guān)土壤微生物群落的信息[23]。這些方法各有優(yōu)缺點(diǎn),正確選擇合適的方法進(jìn)行研究,有助于更地了解根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)特征。

1.2 根際微生物活性和功能多樣性的研究方法及根際PGPR活性

研究根際微生物活性的經(jīng)典方法,是將細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng)、分離并作理化試驗(yàn)。另一個方法是利用細(xì)菌在不同培養(yǎng)基上的生長速率來表征該菌在環(huán)境中的生理特性、養(yǎng)分利用特點(diǎn)和自適應(yīng)策略[24]。

目前,人們廣泛采用某一關(guān)鍵酶活性的測定來表征某類群微生物的多樣性和代謝活性。此外,Biolog體系也是應(yīng)用較為廣泛的方法之一[16,25]。另外,通過克隆構(gòu)建大片段DNA文庫(如BAC library),有助于更地揭示土壤中可培養(yǎng)和不可培養(yǎng)微生物,以及土壤微生物生態(tài)系統(tǒng)的相關(guān)信息[22]。未來土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的研究無疑會大量運(yùn)用DNA微陣列技術(shù)[22],因?yàn)樵摷夹g(shù)可以利用其高特異性特點(diǎn),將不同活性微生物區(qū)分開,并有助于解釋同一菌株在不同環(huán)境土壤樣本中的生態(tài)位的異同。當(dāng)然,基因轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)組學(xué)等技術(shù)也是未來微生物學(xué)研究中不可或缺的輔助手段[22,26]。

根際微生物多樣性反映了微生物群落的代謝活躍程度。在土壤中接種PGPR,只要能存活,無論是否改變微生物群落結(jié)構(gòu),都會在一定程度上影響群落的代謝活性[15]。因此,接種PGPR是否能在土壤中存活并競爭是一個十分關(guān)鍵的問題,受物理的(質(zhì)地、溫度和濕度等)、化學(xué)的(pH、養(yǎng)分的可利用性、有機(jī)質(zhì)含量等)以及和根際其他微生物之間的互作關(guān)系等因素的影響。其中,PGPR與根際土著微生物的互作關(guān)系是一個十分重要的影響因子,因?yàn)榻臃NPGPR需要在根際形成新的生態(tài)位,并在根際定殖,且能競爭足夠的養(yǎng)分。總之,接種PGPR后,要能以有限的群體發(fā)揮應(yīng)有的生物效應(yīng)。

目前,人們可借助多種技術(shù)研究根際土壤微生物活性,比如前面介紹過的同位素(3H、14C)標(biāo)記DNA的胸腺嘧啶核苷或蛋白質(zhì)的亮氨酸組分,來估算群落代謝活性和生長狀況[7,27]。此外,還可以用SIR技術(shù)定量測定根際微生物活性[8]。

2 PGPR生態(tài)及遺傳多樣性

近些年來,由于人們愈加深刻地認(rèn)識到根際生態(tài)系統(tǒng)的重要性,加之PGPR作用機(jī)制研究的不斷深入[28],越來越多的PGPR被篩選出來并加以鑒定。從結(jié)果看,很多屬都有PGPR的分布。下面以目前PGPR相對集中的幾個屬來闡述其生態(tài)特征和多樣性。

2.1 固氮PGPR(Diazotrophic PGPR)

自生固氮菌大概是首個被發(fā)現(xiàn)具有促生作用的根際微生物。自20世紀(jì)70年代,固氮螺菌屬(Azospirillum sp.)的菌株就已被分離出并應(yīng)用于實(shí)踐[29]。其他還有能起促生作用且能自生固氮的屬種主要有固氮弓菌屬(Azoarcus,Az onexus,Azospira)[30]、布克氏菌屬(Burkholderia sp.)、重氮營養(yǎng)葡糖酸醋桿菌(Gluconacetobacter diazotrophicus)、草螺菌屬(Herbaspirillum sp.)、固氮菌屬(Azotobacter sp.)和多黏類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)等[31]。上述這些細(xì)菌可以從許多種類植物,包括水稻、甘蔗、玉米、高粱以及其他谷物,甚至菠蘿、咖啡豆的根際分離到。

最近,固氮弓菌因其遺傳和代謝多樣性而逐步引起研究者的關(guān)注。該屬細(xì)菌能生長在以羧酸類或乙醇為碳源的培養(yǎng)基上,而且最適生長溫度在37~42 ℃。

2.2 桿菌(Bacillus)

土壤中的G+桿菌有95%屬于芽孢桿菌屬(Bacillus sp.),其余5%屬于節(jié)桿菌(Arthrobacter)和弗蘭克氏菌(Frankia)[32]。許多桿菌能在逆境下形成芽孢以增強(qiáng)生存能力,一些桿菌如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)還具有固氮能力[33]。桿菌類的PGPR具備多種促生能力[14,34,35]。

2.3 假單胞菌(Pseudomonas)

在植物根際土壤G-細(xì)菌中,假單胞菌是數(shù)量最多的一類,該屬中的PGPR也因?yàn)榇偕芰V泛而被人們所熟知[14,36,37]。假單胞菌屬細(xì)菌生態(tài)多樣性豐富,國內(nèi)外已經(jīng)從許多植物根際土壤中分離出大量該屬的細(xì)菌。假單胞菌細(xì)菌往往代謝功能多樣,可以產(chǎn)生抗生素、嗜鐵素或氰類化合物等多種代謝物[38]。這些代謝物通過抑制其他有害微生物以及幫助植物吸收土壤養(yǎng)分,從而影響根際生態(tài)環(huán)境。

2.4 根瘤菌(Rhizobia)

這里提及的根瘤菌是指能在非豆科植物根際進(jìn)行非特異性定殖,并釋放促生調(diào)控因子,如嗜鐵素、氰類化合物或進(jìn)行溶磷等作用,提高土壤養(yǎng)分的可利用性[39]。已有報(bào)道指出,在作物和一些非豆科植物輪作后,其根際微生物數(shù)量會大幅增加[40],這對隨后的作物生長十分有益[41]。

3 PGPR篩選策略

由于野外植物根際土壤是PGPR高密度集中地,因此該區(qū)域成為篩選PGPR的來源地。進(jìn)行篩選工作時,不同土壤類型、植物種類、季節(jié)以及植物生長期都必須考慮,以保障篩選到最多的菌株。且一般土壤根際有2%~5%的細(xì)菌屬于PGPR。由此可見,野外植物根際是篩選PGPR的來源地[4,42]。細(xì)菌成為PGPR的先決條件是,當(dāng)被接種后,能在根際土壤微生物群體中表現(xiàn)出相當(dāng)?shù)母偁幜Α?

篩選PGPR的及時步工作,是獲得足夠多的根際土壤細(xì)菌。通常認(rèn)為根際土壤是指緊密附著在植物根表(1~3 mm區(qū)域)的土壤。試驗(yàn)中,通常將植物根表土壤劇烈抖

精品源自地理科精品源自地理科

掉后,仍緊密附著的土壤作為根際土壤,用于篩選工作。當(dāng)然,根據(jù)研究需要,除了根際土壤細(xì)菌,也可篩選根際內(nèi)生細(xì)菌,因?yàn)檫@部分細(xì)菌也有不少是PGPR。也有一些研究者將植物根用自來水輕柔沖洗,仍附著的土壤被看作根際土壤而進(jìn)行PGPR篩選。

根際土壤充分懸浮于無菌水、磷酸緩沖液或生理鹽水。一些化合物如焦磷酸鹽可作為土壤分散劑,但也可以影響細(xì)胞膜的通透性[43]。一些化學(xué)分散劑,如螯合劑可以用單價(jià)的陽離子(Na+)交換土壤顆粒的多價(jià)陽離子(Ca2+),從而減弱土壤顆粒對細(xì)菌細(xì)胞的離子吸附作用。不少研究者用亞氨基二乙酸制成的離子交換樹脂,如Dowex A1[44]或Chelex-100[45,46]。其他的一些分散劑有Tris緩沖液或六偏磷酸鈉[47]。由于微生物細(xì)胞被其胞外聚合物緊密附著于土壤顆粒,有時也會使用去污劑。Macdonald[44]曾用0.1%的脫氧膽酸鈉作為去污劑,同時用Dowex A1作分散劑處理,土壤微生物的浸出率可提高84%。后來,Herron等[45]將此方法作了改進(jìn),用Chelex-100替代Dowex A1,同時用聚乙二醇6 000(PEG 6 000)溶解并分散土壤微生物。還有人在用吖啶橙染色計(jì)數(shù)土壤細(xì)菌數(shù)量時,用0.2%的六偏磷酸鈉作為溶劑[10]。此外,檸檬酸鹽緩沖劑作土壤溶劑研究微生物細(xì)胞膜磷脂特性[48],Winogradsky溶液用于分子生物學(xué)手段(ARDRA、DGGE或REP-PCR等)研究微生物多樣性。

化學(xué)浸出法一般要結(jié)合物理法,可分為3類:搖蕩法、混合法(均質(zhì)或研磨)和超聲波法。搖蕩法是這3種方法中效率低但卻適用于一些敏感型的細(xì)菌或噬菌體。均質(zhì)化處理會破壞一些細(xì)胞結(jié)構(gòu),特別是G-細(xì)菌,導(dǎo)致浸出液具有選擇性。輕微均質(zhì)化處理結(jié)合化學(xué)分散劑的使用往往具有更高的效率[49]。超聲波處理是這3種方法中效率較高的方法,但對一些黏性土壤,需要對樣品進(jìn)行預(yù)處理[50]。然而,很多如G-的敏感型細(xì)菌會在處理過程中遭到不同程度的破壞,當(dāng)然,選擇較小頻率的超聲波處理可以避免這一情況的發(fā)生。

當(dāng)獲得足夠多的根際細(xì)菌后,有如下兩個策略可以篩選到所需的PGPR:①根據(jù)前文介紹的PGPR一般比較集中的幾個屬,通過選擇性培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法篩選目標(biāo)PGPR。例如,Founoune等[51]用選擇性培養(yǎng)基將熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)從刺槐根際篩選出來;②將所得到的根際細(xì)菌進(jìn)行體外促生能力測定,保留具有促生潛力的菌株。然后對所得菌株進(jìn)行遺傳學(xué)試驗(yàn),剔除同一屬里相似的一些菌株,盡可能獲得多個屬里不同功能的有益菌[42,52,53]。

上述的體外促生能力試驗(yàn)包括:①測定促進(jìn)植物生長的一些激素(如茁長素、赤霉素、細(xì)胞分裂素和生長素等);②1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸脫氨酶(ACC脫氨酶,1-Aminocyclopropanecarboxylic acid)活性檢測,該酶能降解乙烯前體ACC,從而降低植株體內(nèi)乙烯的水平,促進(jìn)根系發(fā)育[54];③溶磷能力測試,細(xì)菌的溶磷能力有助于植物吸收磷素[55];④產(chǎn)嗜鐵素能力測定,能幫助植物吸收鐵質(zhì)[56];⑤固氮能力測定[31];⑥測定細(xì)菌產(chǎn)生某些能降解病原真菌細(xì)胞壁的酶(如幾丁質(zhì)酶或β-1,3-葡聚糖酶)[52]。

通過體外促生能力篩選PGPR是一條可行途徑,但也存在一定局限性。一些菌株的生化途徑是誘導(dǎo)型的,也就是說,一些功能在某一環(huán)境條件下是表達(dá)的,但換個環(huán)境或改變某個培養(yǎng)條件就不表達(dá)了。因此,試驗(yàn)中往往會出現(xiàn)一些PGPR菌株在實(shí)驗(yàn)室條件下是有效的,但在根際條件下卻失去這種作用。比如,一些與土壤磷素或鐵質(zhì)等養(yǎng)分相關(guān)的PGPR,往往在土壤磷素或鐵質(zhì)含量豐富的情況下作用不明顯。

還有一個問題值得關(guān)注,一些具有抗病能力的細(xì)菌在傳代過程中,由于該菌產(chǎn)生的特異性轉(zhuǎn)化酶(Site-specific invertase)容易使其發(fā)生“相位變異”(Phase variation),當(dāng)發(fā)生這種情況后,細(xì)菌的某些表型會發(fā)生重大變化。這也是一些細(xì)菌在實(shí)驗(yàn)室條件下表現(xiàn)出PGPR特性,但一段時間后,促生能力卻消失的原因之一[57]。

篩選工作之后,對體外試驗(yàn)獲得成功的PGPR菌株還應(yīng)該在實(shí)際植物生長過程中起到相同的作用。值得注意的是,PGPR往往對不同的植物所起作用不同[58],但具體原因至今仍不清楚,此外PGPR在根際的競爭機(jī)制也不十分明了。接種PGPR可能會改變根際微生物群落,這有可能對植物間接促生[59]。當(dāng)然,接種PGPR也不一定會改變根際微生物群落,也有可能只建立自身的群落,但并不改變根際微生物群落[59]。

最近的一些關(guān)于PGPR篩選的報(bào)道,都遵循上述策略。Kumar等[60]從生長在貧瘠土壤的番茄根際分離出細(xì)菌,再通過解磷、產(chǎn)IAA、產(chǎn)HCN、產(chǎn)嗜鐵素、幾丁質(zhì)酶和β-1,3-葡聚糖酶活性測定,確定多株細(xì)菌具有促生潛力,并在隨后的芝麻種植中進(jìn)一步試驗(yàn),確立1株細(xì)菌(Pseudomonas aeruginosa LES4)具有明顯促生能力;Jha等[61]采集低氮土壤的水稻根際土壤,用不同碳源和不同pH的無氮介質(zhì)進(jìn)行富集培養(yǎng),從中篩選出多株固氮細(xì)菌;Ahmad等[62]則采用3種選擇性培養(yǎng)基(Jensen’s medium, King’s B medium, Nutrient agar)分別將不同植物根際土壤的固氮菌、假單胞菌和芽孢桿菌分離出來,再通過上述常用的促生指標(biāo)逐一進(jìn)行鑒定,從而分離出目標(biāo)PGPR。

4 展望

研究者對微生物生態(tài)學(xué)的研究逐漸趨熱,反映了微生物在生態(tài)系統(tǒng)中 的重要性。土壤微生物是生物圈中物質(zhì)能量循環(huán)的重要組成成分,在植物根際,這一功能尤為顯著。植物通過根際分泌有機(jī)物質(zhì),高選擇性地選擇適合其健康生長的細(xì)菌,導(dǎo)致根際細(xì)菌多樣性減少,但卻為篩選植物根際促生菌提供了來源。

接種PGPR可能會對根際微生物群落產(chǎn)生影響,由于這種影響關(guān)系到PGPR的作用效果,因而需要對此詳加研究。另外值得關(guān)注的是,由于關(guān)系到PGPR和植物的互作關(guān)系,PGPR和其他微生物的“對話機(jī)制”(如群體感應(yīng)等)值得進(jìn)一步研究。

今后需要進(jìn)一步加強(qiáng)根際微生物生態(tài)學(xué)研究,這有助于獲得一些不同功能的微生物,并幫助人們解決不同的環(huán)境問題。未來PGPR生態(tài)學(xué)研究會越來越多地應(yīng)用一些先進(jìn)技術(shù),如DNA/RNA微陣列技術(shù),更好地揭示PGPR結(jié)構(gòu)及功能多樣性。此外,為提高PGPR的應(yīng)用效果,細(xì)菌群體感應(yīng)等機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

微生物論文:不同培肥措施對新建設(shè)施土壤微生物產(chǎn)生的影響

自天津市“4412”工程啟動以來,設(shè)施農(nóng)業(yè)面積逐年增加,加強(qiáng)新增部分設(shè)施農(nóng)業(yè)基地土壤科學(xué)培肥顯得非常重要。傳統(tǒng)培肥措施普遍存在不考慮土壤理化性狀、生物性狀、結(jié)構(gòu)等方面的破壞,只考慮短期效益,盲目大肥投入,培肥效果不穩(wěn)定[1-3]。土壤微生物在土壤養(yǎng)分分解轉(zhuǎn)化過程中起著不可替代的作用。主要包括了細(xì)菌、放線菌和真菌,土壤細(xì)菌占土壤微生物總數(shù)量的70%~90%,放線菌約占土壤微生物總量的5%~20%。設(shè)施土壤與露地土壤相比環(huán)境條件發(fā)生了很大變化,主要是設(shè)施條件下獨(dú)特的小氣候條件和耕作強(qiáng)度,全年條件下高溫高濕和含有大量微生物的有機(jī)肥的施用都有利于微生物的生長、繁殖,加快土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化,真正提高土壤肥力水平和土壤生物多樣性水平[4-5]。生物有機(jī)肥料是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中重要的物質(zhì)基礎(chǔ),能為作物提供的營養(yǎng),它肥效長,可以增加和更新土壤有機(jī)質(zhì),促進(jìn)微生物繁殖,增強(qiáng)土壤保水保肥能力[6-7]。長期施用化肥,不僅消耗土壤有機(jī)質(zhì),導(dǎo)致地力下降,而且使單位化肥養(yǎng)分的增產(chǎn)率呈現(xiàn)遞減趨勢,并引起農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)下降。生物有機(jī)肥料能明顯改善根際土壤微生物環(huán)境,顯著提高土壤酶活性[8]。連年集中施用生物有機(jī)肥可改善作物根際土壤的理化性狀,增強(qiáng)土壤生物活性,達(dá)到改良土壤、提高土壤肥力的目的[9]。科學(xué)合理地施用生物有機(jī)肥是保障生產(chǎn)無污染品質(zhì)蔬菜的一項(xiàng)重要技術(shù)措施。筆者以菜瓜作為栽培作物,通過在新建設(shè)施土壤上采取多種培肥措施,研究分析了不同培肥技術(shù)措施對菜瓜產(chǎn)量、產(chǎn)值以及對土壤微生物數(shù)量的影響。

1 材料和方法

2 結(jié)果與分析

2.1 培肥措施對產(chǎn)量和產(chǎn)值的影響

2.2 培肥技術(shù)肥料成本分析

不同培肥技術(shù)措施,投入成本也不相同,具體統(tǒng)計(jì)見表4。按照10號棚不同培肥措施分析,生物復(fù)合肥與減半量的糞肥和復(fù)合肥結(jié)合培肥模式產(chǎn)量較高,比常規(guī)施肥節(jié)省2 220元·hm-2;根據(jù)13號棚不同培肥措施分析,秸稈還田、堆漚糞肥、生物復(fù)合肥和配方肥集成措施增產(chǎn)效果十分突出,比常規(guī)施肥模式肥料投入成本僅僅高2 400元·hm-2。

2.3 培肥技術(shù)對土壤微生物數(shù)量的影響

針對堆漚糞肥、商品有機(jī)肥、秸稈還田、生物菌肥等不同培肥措施,對土壤細(xì)菌、真菌、放線菌總數(shù)進(jìn)行調(diào)查分析,具體結(jié)果如表5。

根據(jù)對新建后種植一茬的土壤微生物總量分析結(jié)果,不同的培肥處理細(xì)菌和放線菌總數(shù)增加明顯,這與有機(jī)肥的使用、秸稈還田、土壤剖面性狀的改善及通透性的改善有關(guān)。培肥后細(xì)菌增加了2~3倍左右,放線菌增加了10倍多。根據(jù)不同培肥措施來比較:秸稈還田+堆漚糞肥+生物復(fù)合肥+配方肥綜合培肥措施,對土壤微生物數(shù)量影響較大。土壤中的微生物種類繁多,數(shù)量極大,1 g肥沃土壤中通常含有幾億到幾十億個微生物,貧瘠土壤每g也含有幾百萬至幾千萬個微生物,微生物種類和數(shù)量越多,土壤越肥沃。通過培肥的施用,土壤中的微生物成倍的增加,有助于腐殖質(zhì)、有機(jī)質(zhì)的形成,腐殖質(zhì)分解,釋放出其中的養(yǎng)分供植物吸收利用。土壤中的真菌有許多能分解纖維素、木質(zhì)素和果膠等,對自然界物質(zhì)循環(huán)起重要作用[10]。

3 結(jié)論

(1) 西青區(qū)王穩(wěn)莊鎮(zhèn)新建設(shè)施基地土壤,耕層淺,耕層土壤有機(jī)質(zhì)、全氮、全磷、有效磷含量較低。

(2)針對新建設(shè)施,通過在菜瓜上采取施用配方肥、秸稈還田、施用有機(jī)肥等培肥措施示范比較,減半量的生物復(fù)合肥、堆漚糞肥和復(fù)合肥結(jié)合培肥模式比常規(guī)施肥增產(chǎn)2 430 kg·hm-2、節(jié)本增效3 825元·hm-2,秸稈還田+堆漚糞肥+生物復(fù)合肥+配方肥集成措施比常規(guī)施肥模式增產(chǎn)23 610 kg·hm-2,節(jié)本增效15 705元·hm-2。

(3)本試驗(yàn)培肥后,土壤細(xì)菌增加了2~3倍左右,放線菌增加了10倍多,根據(jù)不同培肥措施來比較:秸稈+堆漚糞肥+生物復(fù)合肥+配方肥集成培肥措施對土壤微生物數(shù)量影響較大。但是,值得探討的是,農(nóng)民對生物有機(jī)肥和普通有機(jī)肥不認(rèn)可的原因在于單一生物肥與化肥結(jié)合作底肥,效果一般的原因在于新建設(shè)施基地土壤質(zhì)地較差,土壤通透性低,保肥保水與供肥能力差,根據(jù)試驗(yàn)分析可見,新建設(shè)施土壤培肥不能單純依賴商品生物肥或有機(jī)肥來改善土壤結(jié)構(gòu),應(yīng)當(dāng)適當(dāng)配合增施一些畜禽糞肥以提高商品有機(jī)肥或生物肥效果的發(fā)揮[11-12]。

微生物論文:淺析微生物采油技術(shù)的發(fā)展前景

自從20世紀(jì)20年代美國人Beckman提出利用微生物提高原油產(chǎn)量的想法,到50年代礦場試驗(yàn)成功,美國對生物采油技術(shù)的發(fā)展做出重大貢獻(xiàn)。50年代末到70年代,此項(xiàng)技術(shù)在前蘇聯(lián)和東歐一些國家取得了較為顯著的進(jìn)步。目前,美國和俄羅斯是微生物采油技術(shù)的兩大研究陣地,二者都主張將微生物代謝的產(chǎn)物作為驅(qū)油劑使用,從而提高石油采收率,但又有所不同。美國側(cè)重于培養(yǎng)篩選菌種注入油藏,在實(shí)際應(yīng)用中絕大多數(shù)項(xiàng)目都是成功的,并在兩次微生物采油經(jīng)濟(jì)評價(jià)中,分別使石油產(chǎn)量增加百分之十三和百分之十九點(diǎn)六。俄羅斯主張利用營養(yǎng)物激活原油本源微生物,大量的礦場試驗(yàn)表明這種方式效果十分顯著。相較而論我國微生物采油技術(shù)起步較晚,60年代,勝利油田曾經(jīng)開展過微生物采油的相關(guān)研究,但后來很可惜因種種原因沒能夠堅(jiān)持到底而中途夭折。進(jìn)入90年代后,方呈現(xiàn)出一片繁榮的景象,無論是理論實(shí)驗(yàn)還是實(shí)際應(yīng)用都取得了巨大的進(jìn)展,總體技術(shù)已經(jīng)接近國際先進(jìn)水平,呂振山等學(xué)者利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)(利用DNA在體外攝氏95度時解旋,55度時引物與單鏈按堿基互補(bǔ)配對的原則結(jié)合,再調(diào)溫度至72度左右DNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互補(bǔ)鏈,放大特定的DN段,可看作生物體外的特殊DNA復(fù)制)對多種微生物進(jìn)行基因檢測,并對菌種的油藏適應(yīng)性、增殖地下運(yùn)移能力、和增采能力進(jìn)行了的認(rèn)證;微生物驅(qū)油的數(shù)學(xué)模型在雷光倫等學(xué)者的努力下也初步實(shí)現(xiàn)了化和完整化;采油微生物代謝物及其分析研究也取得了可喜的成績,包木太等學(xué)者用力甚勤,中國有望后來居上,成為微生物采油技術(shù)最為先進(jìn)的主要國家之一。

微生物采油技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)

菌種選擇標(biāo)準(zhǔn)。菌種篩選是微生物采油技術(shù)的關(guān)鍵,菌種選擇的優(yōu)劣將直接影響到采油效果的實(shí)現(xiàn)。目前使用的方式主要有培養(yǎng)基因工程采油菌和篩選自然采油菌兩類。就國內(nèi)情況來講,早期目標(biāo)是篩選出能夠適應(yīng)地層環(huán)境的菌種,它們可以提供適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)營養(yǎng)物,使微生物的生長代謝產(chǎn)物可以起到驅(qū)除地層中殘油的作用就可以。隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步,菌種篩選要求亦越來越高,菌種耐溫性得到較大的重視,這是因?yàn)槟蜏匦阅茉胶?其適用的油藏范圍越廣;菌種應(yīng)耐礦化度,降低營養(yǎng)物成本。油藏環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)。微生物的正常生長是在一定的環(huán)境條件進(jìn)行的,不同的油層條件需要配置不同的微生物溶液,同樣采用微生物技術(shù)也需要滿足特定的油藏環(huán)境標(biāo)準(zhǔn),主要包括溫度、深度、壓力、礦化度、滲透率等,有學(xué)者已統(tǒng)計(jì)出選擇微生物處理的油層條件,在此列出,以備參考。

未來研究前景

微生物采油技術(shù)含量較高,同時也是一門新興的交叉學(xué)科。在未來的科學(xué)研究中,筆者建議:首先,注重提高采收率的機(jī)理研究。微生物采油應(yīng)用技術(shù)正日臻完善,驅(qū)油機(jī)理方面的研究尚有欠缺,仍有進(jìn)一步發(fā)展的必要。其次,微生物采油數(shù)學(xué)模型的研究亦有待深入,開發(fā)模型軟件,建立系統(tǒng)的微生物與鹽水相互作用研究體系,加強(qiáng)微生物在孔介質(zhì)中的運(yùn)動規(guī)律研究。再次,加強(qiáng)與其他學(xué)科的交叉研究。微生物采油技術(shù)涉及到生物、石油、地質(zhì)、化學(xué)等多學(xué)科的知識內(nèi)容,因此,需要有關(guān)學(xué)科的專家通力合作,共同發(fā)展,相互幫助,最終使微生物采油技術(shù)的發(fā)展得到質(zhì)的飛躍。(本文作者:張洪林 單位:中油國際阿克糾賓油氣股份公司)

微生物論文:分析微生物燃料電池知識引入高中化學(xué)

【關(guān)鍵詞】引入,高中,化學(xué),知識,電池,燃料,分析,電子,微生物,傳遞

微生物燃料電池(microbial fuel cell,MFC)是利用微生物的催化反應(yīng)將化學(xué)能直接轉(zhuǎn)化為電能的裝置,其基本構(gòu)造與普通燃料電池類似,如圖1所示。微生物燃料電池的陽極通常選用導(dǎo)電性能較好的石墨、碳布和碳紙等材料,陰極則大多使用載鉑碳材料。保持陽極池?zé)o氧,陰極池有氧,兩池之間的陽離子半透膜使H+自由通過,氧氣不能通過。連接兩極的外電路中串聯(lián)電阻器或其他電子設(shè)備[1~3]。

圖1 微生物燃料電池構(gòu)造示意圖

與傳統(tǒng)燃料電池不同的是,微生物燃料電池的陽極反應(yīng)是靠微生物催化氧化有機(jī)物(底物)而產(chǎn)生電子和質(zhì)子。電子通過導(dǎo)線傳遞到陰極,質(zhì)子通過半透膜滲入陰極池。陰極池中,氧氣、質(zhì)子、電子反應(yīng)生成水。常用葡萄糖作為底物,反應(yīng)如下[4]:

陽極反應(yīng):C6H12O6+6H2O6CO2+24e-+24H+

陰極反應(yīng):6O2+24e-+24H+12H2O

電池反應(yīng):C6H12O6+6O26CO2+6H2O

2 微生物燃料電池的產(chǎn)電機(jī)制

微生物燃料電池的產(chǎn)電過程可分解為5個步驟:(1)底物生物氧化:陽極池中,底物在微生物作用下被氧化,產(chǎn)生電子、質(zhì)子及代謝產(chǎn)物;(2)產(chǎn)生的電子從微生物細(xì)胞傳遞至陽極表面;(3)電子經(jīng)外電路傳輸至陰極;(4)產(chǎn)生的質(zhì)子穿過半透膜,從陽極池遷移至陰極池,到達(dá)陰極表面;(5)陰極池中,電子受體(如氧氣等)與遷移來的質(zhì)子和電子在陰極表面發(fā)生還原反應(yīng)。通常,前2個步驟是限速步驟,即電子的產(chǎn)生與傳遞效率是影響MFC輸出功率的最重要因素[2,5]。

2.1 底物生物氧化

2.1.1 產(chǎn)電呼吸代謝[5,6]

微生物在無氧的陽極池中會發(fā)生產(chǎn)電呼吸代謝,即通過呼吸代謝過程產(chǎn)生電子、質(zhì)子及代謝產(chǎn)物。微生物的代謝途徑?jīng)Q定電子與質(zhì)子的流量,它與底物有關(guān),而陽極電勢也對它起著決定性作用。

陽極電勢較高時,微生物經(jīng)呼吸鏈進(jìn)行代謝,電子和質(zhì)子通過NADH還原酶、輔酶Q及細(xì)胞色素進(jìn)行傳遞;陽極電勢較低,且存在硫酸鹽等其他電子受體時,電子會在這些電子受體上累積,而不與陽極反應(yīng);當(dāng)不存在硫酸鹽、硝酸鹽和其他電子受體時,微生物主要進(jìn)行發(fā)酵,代謝過程也會釋放少量電能,同時醋酸等發(fā)酵產(chǎn)物可被某些微生物繼續(xù)代謝,釋放電子。

2.1.2 陽極微生物

陽極微生物的種類決定陽極的電子傳遞方式,如表1所示。理論上各種微生物均可用于MFC,但由于細(xì)胞壁中的肽鍵等不良導(dǎo)體的阻礙,大多數(shù)微生物產(chǎn)生的電子不能傳出體外,因而不具有直接的電化學(xué)活性。通常采用添加可溶性氧化還原介體作為電子傳遞中間體的方法,實(shí)現(xiàn)電子由細(xì)胞內(nèi)傳遞至陽極表面。此類MFC稱為間接MFC(或有介體MFC),其工業(yè)化應(yīng)用由于介體大多有毒、易流失、價(jià)格較高而受到很大阻礙[2,7]。

微生物通過代謝活動能產(chǎn)生一些自身生長和繁殖所必需的物質(zhì),如氨基酸、核苷酸等,這些物質(zhì)稱為微生物的初級代謝產(chǎn)物。一些微生物能以產(chǎn)生的H2、H2S等初級代謝產(chǎn)物作為氧化還原介體,例如Harbermann等設(shè)計(jì)出利用Desulfovibrio desulfurcan菌種生成的硫化物作為介體的微生物燃料電池。該系統(tǒng)不經(jīng)任何維護(hù)連續(xù)可運(yùn)行5年,其電池反應(yīng)如下[1]:

2+2H2O2CO2+8H++8e-

代表有機(jī)燃料

SO2-4+8H++8e-S2-+4H2O

陽極反應(yīng):S2-+4H2OSO2-4+8H++8e-或8/3S2-+4H2O4/3S2O2-3+8H++8e-

陰極反應(yīng):2O2+8H++8e-4H2O

有一些微生物(如綠膿桿菌)自身能生成易還原的次級代謝產(chǎn)物,影響電子傳遞。次級代謝產(chǎn)物指以初級代謝產(chǎn)物為前體合成的,對微生物的生命活動無明確功能的物質(zhì)。

近年來,研究者發(fā)現(xiàn)了多種不需介體就可將代謝產(chǎn)生的電子通過細(xì)胞膜直接傳遞到電極表面的微生物——產(chǎn)電微生物。此類微生物以位于細(xì)胞膜上的細(xì)胞色素或自身分泌的醌類物質(zhì)作為電子載體,將電子由細(xì)胞內(nèi)傳遞至電極上,這種MFC稱為直接MFC(或無介體MFC)。

2.2 陽極還原[2,8]

陽極還原指電子由微生物細(xì)胞內(nèi)傳遞至陽極表面,是電池產(chǎn)電的關(guān)鍵步驟,也是制約產(chǎn)電性能的主要因素之一。常見的陽極電子傳遞方式主要有4種:直接接觸傳遞、納米導(dǎo)線輔助遠(yuǎn)距離傳遞、電子穿梭傳遞和初級代謝產(chǎn)物原位氧化傳遞。前2種屬于生物膜機(jī)制,后2種屬于電子穿梭機(jī)制。2種機(jī)制可能同時存在,協(xié)同作用,促進(jìn)產(chǎn)電過程。

A直接接觸 B納米導(dǎo)線 C氧化還原介體D還原態(tài)初級代謝產(chǎn)物原位氧化

圖2 微生物燃料電池陽極電子傳遞機(jī)制示意圖

2.2.1 生物膜產(chǎn)電機(jī)制

生物膜產(chǎn)電機(jī)制指微生物在電極表面聚集形成膜,通過直接接觸或納米導(dǎo)線輔助作用而轉(zhuǎn)移電子。這是一種無介體電子傳遞機(jī)制。

直接接觸傳遞指與陽極表面接觸的產(chǎn)電微生物菌體可通過細(xì)胞膜外側(cè)的C型細(xì)胞色素,將呼吸鏈中電子的直接傳遞至電極表面,如圖2A所示。該方式只是緊靠電極表面的一單層微生物可傳遞電子給電極,因此電池性能受限于電極表面這一單層微生物的較大細(xì)菌濃度。

近期研究表明,某些細(xì)菌的細(xì)胞表面存在一種可導(dǎo)電的納米級纖毛或菌毛,起到電子導(dǎo)管的作用,依靠這些納米導(dǎo)線輔助,可進(jìn)行遠(yuǎn)距離電子傳遞。這些表面纖毛的一端與細(xì)胞外膜相連,另一端與電極表面直接接觸,將細(xì)胞外膜上的電子傳遞至電極表面,實(shí)現(xiàn)電子轉(zhuǎn)移,如圖2B所示。這些菌毛可使電子傳遞到離細(xì)胞表面更遠(yuǎn)處,進(jìn)行較遠(yuǎn)距離的電子傳遞,從而可形成較厚的具有產(chǎn)電活性的生物膜,提高電池性能。

2.2.2 電子穿梭產(chǎn)電機(jī)制

電子穿梭產(chǎn)電機(jī)制指微生物利用外加或自身分泌的電子穿梭體(氧化還原介體),將代謝產(chǎn)生的電子轉(zhuǎn)移至電極表面。根據(jù)介體的不同,有介體電子傳遞可分外源介體的有介體電子傳遞、還原態(tài)初級代謝產(chǎn)物原位氧化傳遞、微生物次級代謝物為介體的電子傳遞。

外源介體的有介體電子傳遞過程如圖2C所示。底物在微生物作用下被氧化,進(jìn)入微生物細(xì)胞內(nèi)并處于氧化態(tài)的介體捕獲釋放出的電子而被還原,處于還原態(tài)的介體被微生物排泄出體外,在陽極表面失去電子被氧化,從而將電子傳遞到電極上。

自身可分泌具有電子傳遞功能的氧化還原介體的微生物,主要將代謝物作為介體來進(jìn)行電子傳遞。其中,以次級代謝物為介體進(jìn)行電子傳遞的MFC,消除了添加外源介體帶來的各種問題,引起特別關(guān)注,其傳遞過程也可用圖2C表示。在微生物體內(nèi)分泌產(chǎn)生的氧化態(tài)次級代謝物作為可逆的末端電子受體,將電子傳遞至細(xì)胞外,在陽極表面發(fā)生電子轉(zhuǎn)移,還原態(tài)介體重新被氧化,進(jìn)入下一氧化還原過程。另有一些微生物能以代謝過程中產(chǎn)生的如H2、H2S等初級代謝產(chǎn)物作為氧化還原介體進(jìn)行電子傳遞,如圖2D所示。作為陽極氧化的還原劑,初級代謝物介體需要滿足一些條件,即氧化還原電勢應(yīng)較低,但不能低于底物的氧化電勢,且在MFC中易于電化學(xué)氧化。

微生物論文:對環(huán)境工程微生物實(shí)驗(yàn)教學(xué)改革的探索

環(huán)境工程微生物學(xué)是環(huán)境工程專業(yè)學(xué)生必修的專業(yè)基礎(chǔ)課程,是一門實(shí)踐性很強(qiáng)的應(yīng)用學(xué)科。實(shí)驗(yàn)課是環(huán)境工程微生物教學(xué)的重要組成部分,它是培養(yǎng)和訓(xùn)練學(xué)生的實(shí)驗(yàn)操作能力、獨(dú)立分析問題、解決問題能力的重要環(huán)節(jié)。環(huán)境微生物的一些基本技術(shù)如無菌操作、培養(yǎng)基制備、消毒與滅菌、微生物的培養(yǎng)分離計(jì)數(shù)等在環(huán)境污染處理的應(yīng)用領(lǐng)域中應(yīng)用十分廣泛。隨著生物工程技術(shù)的發(fā)展,現(xiàn)代生物技術(shù)如基因重組、PCR技術(shù)也在環(huán)境工程得到應(yīng)用。近年來我國高等教育規(guī)模急劇擴(kuò)張,教學(xué)實(shí)踐資源日趨緊張。如何改革環(huán)境工程微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的內(nèi)容及授課方式,一直是大學(xué)環(huán)境類課程建設(shè)的重要內(nèi)容。近年來,我們對環(huán)境工程微生物的實(shí)驗(yàn)教學(xué)進(jìn)行了改革探索,目的是進(jìn)一步提高環(huán)境工程微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)效率,培養(yǎng)具備理論知識扎實(shí)、動手能力強(qiáng)的大學(xué)畢業(yè)生。

1?改革實(shí)驗(yàn)課程的設(shè)置

我們將過去獨(dú)立、互不相關(guān)的微生物實(shí)驗(yàn)改為一連續(xù)的探索性的大實(shí)驗(yàn),開設(shè)了一門“環(huán)境工程微生物綜合訓(xùn)練”的獨(dú)立課程。課程放置在學(xué)期結(jié)束時的實(shí)踐周中進(jìn)行,集中對學(xué)生進(jìn)行微生物的培養(yǎng)、分離、鑒定和污水處理應(yīng)用的基本操作的訓(xùn)練過程,這樣強(qiáng)化了對學(xué)生基本技能和動手能力的培養(yǎng)。綜合訓(xùn)練的主要內(nèi)容包括:首先在制備各類培養(yǎng)的基礎(chǔ)上,采取不同的環(huán)境樣品中進(jìn)行接種、培養(yǎng),通過菌落和個體形態(tài)觀察,純化細(xì)菌、放線菌或霉菌和酵母菌,然后學(xué)生以自己分離、純化的菌種為材料繼續(xù)進(jìn)行以后的實(shí)驗(yàn),在對細(xì)菌形態(tài)觀察、革蘭氏染色和菌體大小測定基礎(chǔ)上,做細(xì)菌的生理生化試驗(yàn),對細(xì)菌做出初步鑒定,并將分離出來的細(xì)菌用于生活污水的處理上。環(huán)境工程微生物綜合訓(xùn)練的主要實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和所涉及的知識點(diǎn)見表1。改革后的綜合訓(xùn)練使原來孤立、不連續(xù)的實(shí)驗(yàn)形成一個連續(xù)的整體。在微生物的菌種的培養(yǎng)和分離,純種的計(jì)數(shù)和鑒定等方面強(qiáng)化了學(xué)生的實(shí)驗(yàn)技能。各種基本操作技能在微生物綜合訓(xùn)練中多次操作,反復(fù)應(yīng)用,能大大提高學(xué)生的微生物技能的綜合應(yīng)用能力。

驗(yàn)證操作性實(shí)驗(yàn)相對較多,設(shè)計(jì)性、綜合性實(shí)驗(yàn)相對較少是目前實(shí)驗(yàn)課程教學(xué)中的突出問題,這對培養(yǎng)實(shí)用型人才極為不利,也不利于調(diào)動學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣和積極性。我們將一些應(yīng)用性、綜合性和學(xué)生感興趣的實(shí)驗(yàn)課題,作為選作實(shí)驗(yàn),供感興趣的學(xué)生通過查閱相關(guān)資料,綜合運(yùn)用不同實(shí)驗(yàn)技術(shù),設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案,通過教師指導(dǎo)和小組討論確定方案并加以實(shí)施。實(shí)驗(yàn)后綜合分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果,撰寫科創(chuàng)論文。比如,“微生物誘導(dǎo)腐蝕”的選作實(shí)驗(yàn),主要是研究研究厭氧微生物對金屬腐蝕過程,使同學(xué)們擴(kuò)大對微生物環(huán)境作用的了解,增強(qiáng)學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣和實(shí)踐動手能力。這樣,既能提高學(xué)生對實(shí)驗(yàn)的興趣,又能促使他們將所學(xué)的理論知識應(yīng)用起來,從而加深對環(huán)境工程微生物課堂教學(xué)內(nèi)容的理解。(如表1)

2?重視視頻實(shí)驗(yàn)教學(xué)的應(yīng)用

微生物個體微小,學(xué)生對它的感性認(rèn)識不多,這使得許多有關(guān)微生物的概念變得抽象、難以理解。在實(shí)驗(yàn)教學(xué)中,有目的的引入了視頻實(shí)驗(yàn)等多媒體教學(xué)的方法,可以增加實(shí)驗(yàn)教學(xué)的直觀性和趣味性,并在一定程度上彌補(bǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)經(jīng)費(fèi)緊張等問題。我們不僅制作了環(huán)境工程微生物的多媒體課件,而且采用視頻教學(xué)短片,向?qū)W生展示基本的實(shí)驗(yàn)操作,以及相關(guān)實(shí)驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展及其在生產(chǎn)或科研中的應(yīng)用。這些改革以視頻的形式向?qū)W生展示實(shí)驗(yàn)的基本過程,具有較強(qiáng)的直觀性,通過屏幕清晰形象地展現(xiàn)每一個步驟,使學(xué)生掌握實(shí)驗(yàn)操作技能的關(guān)鍵所在加深了學(xué)生對使微生物的實(shí)驗(yàn)規(guī)程和操作技巧理解,如無菌操作技術(shù)、微生物的分離和培養(yǎng)技術(shù)、消毒滅菌技術(shù)、斜面、液體、平板接種培養(yǎng)方法等。采用多媒體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)教學(xué),具有形象、生動、信息量大的優(yōu)點(diǎn),結(jié)合教師在實(shí)驗(yàn)過程中的講授和示范,有利于學(xué)生在腦海里建立每一種實(shí)驗(yàn)操作的標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)范。因此應(yīng)該加強(qiáng)多媒體在環(huán)境微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中的應(yīng)用。

3?強(qiáng)調(diào)實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備工作

傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)課程教學(xué)方法是由實(shí)驗(yàn)教師幫助學(xué)生完成很大一部分準(zhǔn)備工作,學(xué)生只是按教師的講解和實(shí)驗(yàn)手冊的步驟進(jìn)行操作。我們在微生物綜合訓(xùn)練中,改變實(shí)驗(yàn)課中講解過多的現(xiàn)象,只是重點(diǎn)講述實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵并事先提出思考題,讓學(xué)生們帶著問題去進(jìn)行實(shí)驗(yàn),讓學(xué)生通過實(shí)驗(yàn)歸納出結(jié)論,從而理解和驗(yàn)證微生物學(xué)的基本原理。教師在實(shí)驗(yàn)中起指導(dǎo)作用,著重培養(yǎng)學(xué)生的動手能力。由于綜合實(shí)驗(yàn)涉及的內(nèi)容很多,所以我們要求學(xué)生先復(fù)習(xí)以前學(xué)過的知識并寫出實(shí)驗(yàn)計(jì)劃(包括實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹⒃怼x器、材料、步驟),然后在課堂上對實(shí)驗(yàn)計(jì)劃進(jìn)行討論,討論后學(xué)生再進(jìn)行修改,由教師審定。審定合格后,學(xué)生方可開始進(jìn)行實(shí)驗(yàn),這是可以提高學(xué)生的實(shí)驗(yàn)培訓(xùn)的主動性。實(shí)驗(yàn)從實(shí)驗(yàn)材料的準(zhǔn)備到每一步實(shí)驗(yàn)都由學(xué)生自己動手,教師只起檢查和輔導(dǎo)示范作用。讓學(xué)生明白每個實(shí)驗(yàn)步驟操作的好壞對后續(xù)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行有直接的影響,培養(yǎng)學(xué)生整體的實(shí)驗(yàn)觀念和細(xì)心的操作習(xí)慣。由于是學(xué)生自己進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)備工作,可以加深對實(shí)驗(yàn)的目的、原理、方法、步驟的了解,實(shí)驗(yàn)效果很好。

4?改革實(shí)驗(yàn)課程的考核形式

綜合訓(xùn)練的考核是既是課程設(shè)置的要求,也是對學(xué)生實(shí)驗(yàn)技能學(xué)習(xí)的一種督促和檢查。在微生物綜合訓(xùn)練中,我們將學(xué)生4~5人分為一小組,同一組的每位學(xué)生既有分工又有合作,每位學(xué)生都獨(dú)立進(jìn)行無菌操作、接種培養(yǎng)等工作。在材料的準(zhǔn)備和實(shí)驗(yàn)完成的整個過程中,任何一個步驟的失誤都將直接影響最終結(jié)果,因此我們要求每位學(xué)生規(guī)范操作,仔細(xì)觀察,及時記錄,培養(yǎng)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目茖W(xué)態(tài)度和獨(dú)立操作能力,老師對每位學(xué)生的操作和實(shí)驗(yàn)結(jié)果都做出客觀的評價(jià)。將綜合訓(xùn)練考核分為預(yù)習(xí) 、操作、實(shí)驗(yàn)報(bào)告三部分記分。在實(shí)驗(yàn)過程中,進(jìn)行現(xiàn)場指導(dǎo),當(dāng)場考核,不僅要看實(shí)驗(yàn)報(bào)告,更要依據(jù)預(yù)習(xí)、現(xiàn)場實(shí)驗(yàn)操作和實(shí)驗(yàn)結(jié)果綜合考核。在操作考核中既有單獨(dú)的個人操作考核,也有分組的操作考核。實(shí)驗(yàn)報(bào)告要實(shí)事求是,嚴(yán)格杜絕相互抄襲現(xiàn)象。要求學(xué)生在實(shí)驗(yàn)報(bào)告中對實(shí)驗(yàn)過程和結(jié)果進(jìn)行詳細(xì)記錄和分析,養(yǎng)成一個善于分析問題和總結(jié)問題的好習(xí)慣。實(shí)驗(yàn)報(bào)告中的分析與討論是很重要的內(nèi)容,我們鼓勵學(xué)生在分析討論中自由地寫出自己對實(shí)驗(yàn)的理解,比如哪些操作步驟沒有做好,或者在實(shí)驗(yàn)過程中容易出現(xiàn)什么問題,如何避免等,還可以提出對實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)修改的建議。通過對實(shí)驗(yàn)問題和結(jié)果的分析、討論,可加強(qiáng)學(xué)生對理論知識的理解,大大提高學(xué)生分析問題和解決問題的能力。

通過這些改革措施,使學(xué)生能夠認(rèn)識到實(shí)驗(yàn)課的重要性,同時也提高了實(shí)驗(yàn)課的地位和學(xué)生的積極性,教學(xué)質(zhì)量有較大的提高,為環(huán)境工程專業(yè)后續(xù)課程教學(xué)的展開和將來畢業(yè)論文的順利完成打下基礎(chǔ)。

5?培養(yǎng)工程實(shí)踐觀念

我校是具有電力特色的地方性高等學(xué)校,環(huán)境工程專業(yè)是從電廠化學(xué)專業(yè)基礎(chǔ)上衍生和發(fā)展起來的。我校環(huán)境工程專業(yè)的課程設(shè)置強(qiáng)調(diào)重工程、重實(shí)踐的專業(yè)特色。環(huán)境工程微生物學(xué)需培養(yǎng)學(xué)生分析和解決環(huán)境工程問題的思維模式,要使學(xué)生了解微生物在環(huán)境污染物治理中的作用原理,而不是僅僅停留在微生物學(xué)本身基本的實(shí)驗(yàn)操作上。我們在微生物綜合訓(xùn)練課程設(shè)計(jì)中特別注意結(jié)合工程應(yīng)用問題,充分圍繞教學(xué)隊(duì)伍的科研課題及實(shí)習(xí)單位的生產(chǎn)展開,注重培養(yǎng)學(xué)生的工程實(shí)踐能力。我們根據(jù)本專業(yè)教師承擔(dān)的科研項(xiàng)目,通過課題的形式,組織一些對環(huán)境工程微生物感興趣的學(xué)生,參加到教師的科研項(xiàng)目中。一些老師在設(shè)計(jì)新的污水處理工藝時,經(jīng)常會有很多項(xiàng)目指標(biāo)需要測試,只要合適,我們也將樣品拿來讓學(xué)生在實(shí)驗(yàn)教學(xué)中做。這樣就培養(yǎng)了學(xué)生從工程角度思考和解決實(shí)際問題的能力。

我們學(xué)校毗鄰上海東區(qū)污水處理廠,上海東區(qū)污水處理廠是亞洲建造最早的污水處理廠,也是目前我國的仍在穩(wěn)定運(yùn)行的建于20世紀(jì)20年代的污水處理廠,采用活性污泥法的二級生化處理工藝,其基本原理和設(shè)計(jì)思路已經(jīng)成為當(dāng)今城市污水處理的理論經(jīng)典和工藝核心。上海現(xiàn)有十余座污水處理廠的處理工藝均是在此基礎(chǔ)上的調(diào)整或演化。我們組織學(xué)生在上海東區(qū)污水廠實(shí)習(xí),并對不同運(yùn)行工況下的微生物進(jìn)行監(jiān)控,使學(xué)生們掌握實(shí)際工作中所涉及的微生物的知識和測試技術(shù),深刻了解污水處理工程應(yīng)用過程中微生物的作用。

總之,這些改革探索,主要的目的是增加學(xué)生實(shí)驗(yàn)的主動性,培養(yǎng)學(xué)生積極思考的習(xí)慣,將一些操作性實(shí)驗(yàn)結(jié)合在探究性訓(xùn)練中去,提高了綜合運(yùn)用知識、分析和解決問題的能力,培養(yǎng)了嚴(yán)謹(jǐn)、鉆研、科學(xué)的學(xué)風(fēng)。這也對教師提出了新的要求,也就是不斷開發(fā)新的探究性實(shí)驗(yàn)課題,滿足對學(xué)生實(shí)踐和動手能力的培養(yǎng),適應(yīng)環(huán)境工程微生物課堂教學(xué)發(fā)展的要求。

微生物論文:簡述微生物學(xué)雙語教學(xué)的實(shí)踐與思考

論文關(guān)鍵詞：微生物學(xué) 雙語教學(xué) 實(shí)踐

論文摘要：微生物學(xué)是高等學(xué)校生物類專業(yè)的重要基礎(chǔ)課程之一，學(xué)好微生物學(xué)將為進(jìn)一步學(xué)習(xí)其他專業(yè)課程奠定堅(jiān)實(shí)的微生物學(xué)基礎(chǔ)。微生物學(xué)科發(fā)展日新月異，為使學(xué)生跟蹤發(fā)展前沿，提升學(xué)生對英文的使用能力和綜合素質(zhì)，高等院校應(yīng)推行微生物學(xué)雙語教學(xué)，并應(yīng)加強(qiáng)在教學(xué)體制改革、條件建設(shè)等方面的工作。

微生物學(xué)是高等院校生物類專業(yè)的重要基礎(chǔ)課程之一，學(xué)習(xí)好微生物學(xué)將為進(jìn)一步學(xué)習(xí)其他專業(yè)課程奠定堅(jiān)實(shí)的微生物學(xué)基礎(chǔ)[1]。微生物學(xué)科發(fā)展日新月異，為使學(xué)生跟蹤學(xué)科發(fā)展前沿，提升學(xué)生對英文的使用能力和綜合素質(zhì)，我們從2004年開始進(jìn)行微生物學(xué)雙語教學(xué)的嘗試，取得了較好的效果，并獲得了一些有益的啟示。

一、微生物學(xué)的雙語教學(xué)實(shí)踐

1.關(guān)于教學(xué)大綱和教學(xué)內(nèi)容

本課程總學(xué)時為54學(xué)時，其中理論課36學(xué)時，實(shí)驗(yàn)課18學(xué)時。本課程為雙語教學(xué)課程，旨在為學(xué)生打下牢固微生物學(xué)基礎(chǔ)，培養(yǎng)學(xué)生使用專業(yè)英語的能力，為學(xué)生閱讀英文文獻(xiàn)和進(jìn)行學(xué)術(shù)交流奠定良好的語言基礎(chǔ)。課程內(nèi)容包括微生物形態(tài)、生理、生長、遺傳變異、生態(tài)以及微生物與自然界物質(zhì)循環(huán)關(guān)系5個方面。在內(nèi)容的選取方面，以周德慶主編的《微生物學(xué)教程》（第二版，高等教育出版社，2001年）為基礎(chǔ)，結(jié)合J. Nickllin等主編的Microbiology（影印版，科學(xué)出版社，2003年）以及筆者留學(xué)加拿大麥吉爾大學(xué)帶回的該校微生物學(xué)講義內(nèi)容，既照顧到國內(nèi)微生物學(xué)教學(xué)的傳統(tǒng)體系，也同時吸納了國外同類課程的長處。

2.教材的選用

2004年實(shí)施雙語教學(xué)之初，由于沒有合適的教材，為了應(yīng)急，以J. Nickllin等主編的Microbiology為教材，但是該教材的內(nèi)容和教學(xué)體系畢竟與我們現(xiàn)行的體系存在差異，因此，教材的使用效率比較低較，只有部分章節(jié)被利用。另外，原版教材價(jià)格較高，加重了學(xué)生經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。針對這種情況，我們于2005年著手自編微生物學(xué)雙語教學(xué)教材，該教材的特點(diǎn)是吸收了國外同類教材的優(yōu)點(diǎn)，緊緊結(jié)合教學(xué)內(nèi)容，與教學(xué)進(jìn)度同步，重點(diǎn)突出，條理清晰。另外，我們將教學(xué)內(nèi)容和課堂筆記融入教材，使教材同時起到教學(xué)參考書和筆記的作用，學(xué)生在課堂上可以“以劃代記”，省去記筆記的時間，集中精力去理解和掌握教學(xué)內(nèi)容。與該教材配套的參考書有周德慶主編的《微生物學(xué)教程》和J. Nickllin等主編的Microbiology。

3.關(guān)于課堂教學(xué)

授課之前布置預(yù)習(xí)作業(yè)，督促學(xué)生對授課內(nèi)容和專業(yè)詞匯提前預(yù)習(xí)，做到心中有數(shù)，有針對性地去聽課。課堂教學(xué)語言的使用根據(jù)學(xué)生的理解狀況隨機(jī)調(diào)整，一般課程開始階段英文使用頻率低，隨著學(xué)生理解能力的增強(qiáng)，逐步增加英文的量，減少漢語的量，在內(nèi)容淺顯易懂的章節(jié)，則全部采用英文。全部課程采用多媒體授課，多媒體內(nèi)容絕大部分是英文，在多媒體制作時，盡可能多地采用表格、圖片、動畫等手段，將抽象的教學(xué)內(nèi)容生動化、直觀化，幫助學(xué)生理解授課內(nèi)容。同時多媒體課件上載到校園網(wǎng)，學(xué)生可以隨時隨地上網(wǎng)查看學(xué)習(xí)。一般，在用外語授課以前，用漢語將授課內(nèi)容梗概做以簡單描述，使學(xué)生在基本理解專業(yè)知識原理的前提下再花大氣力用外語授課，這樣會起到事半功倍的效果。針對教學(xué)內(nèi)容和專業(yè)詞匯布置課后作業(yè)，結(jié)合課下答疑和輔導(dǎo)，學(xué)生可以基本消化和掌握授課內(nèi)容。

4.關(guān)于雙語教學(xué)研究

在我國高等院校雙語教學(xué)還是一個新鮮事物，在雙語教學(xué)的實(shí)踐中必然面臨許多困難，需要我們抱著一個探索和研究的態(tài)度去實(shí)踐，不斷發(fā)現(xiàn)問題、解決問題、積累經(jīng)驗(yàn)、創(chuàng)新發(fā)展。因此，有必要對高等教學(xué)中雙語教學(xué)的規(guī)律進(jìn)行專門的研究。筆者結(jié)合自身雙語教學(xué)的實(shí)踐先后主持了4項(xiàng)雙語教學(xué)項(xiàng)目的研究和建設(shè)任務(wù)，通過教學(xué)項(xiàng)目的開展，提升了自身的理論水平和教學(xué)水平，起到了教學(xué)研究和教學(xué)實(shí)踐相互促進(jìn)、相互支撐的作用。

二、高校雙語教學(xué)存在的問題與思考

1.對雙語教學(xué)的認(rèn)識上的誤區(qū)。

目前，雖然我國高等院校中多數(shù)開設(shè)了雙語教學(xué)課程，但在高校中也存在對雙語教學(xué)的重要意義認(rèn)識不足的現(xiàn)象。主要表現(xiàn)為，針對雙語教學(xué)的鼓勵性政策較少、對雙語教學(xué)的投入遠(yuǎn)小于實(shí)際需求，與雙語教學(xué)相配套的改革措施少、雙語教師的培訓(xùn)力度不夠等。國內(nèi)外的經(jīng)驗(yàn)告訴我們，雙語教學(xué)是讓學(xué)生精通掌握外語的有效途徑，要想徹底打破我國外語教育中“投入多、產(chǎn)出少”以及“高分低能”的尷尬僵局，雙語教學(xué)無疑是一條可以借鑒的成功之路，雙語教學(xué)對于中國高等教育的重要意義毋庸置疑，我們必須在這一點(diǎn)上統(tǒng)一認(rèn)識，堅(jiān)定不移地推動雙語教學(xué)的進(jìn)程。當(dāng)然，我們也應(yīng)該充分認(rèn)識到雙語教學(xué)事業(yè)的艱巨性和長期性，認(rèn)識到雙語教學(xué)是一項(xiàng)系統(tǒng)工程，需要社會各方面的共同努力才能完成。我們應(yīng)避免盲目樂觀和急于求成的思想，要腳踏實(shí)地地推進(jìn)工作，充分預(yù)料到可能遇到的困難和挫折，直至取得成效。

2.雙語教學(xué)與現(xiàn)行教育體制在一些方面存在沖突。

雙語教學(xué)與現(xiàn)行外語教學(xué)的沖突。在高校教學(xué)計(jì)劃中，雙語教學(xué)科目所占的學(xué)時數(shù)一般與該科目正常學(xué)時數(shù)一致，由于學(xué)時的限制，雙語教學(xué)很難達(dá)到“制造語言環(huán)境、用外語熏染學(xué)生”的教學(xué)效果，常導(dǎo)致教學(xué)效果不盡人意。而如果大規(guī)模開設(shè)雙語課程，在強(qiáng)調(diào)雙語教學(xué)的同時，勢必會在學(xué)時分配、成績考核方式等方面與常規(guī)的外語教學(xué)產(chǎn)生沖突，因此，我們應(yīng)該協(xié)調(diào)兩者關(guān)系，考慮適當(dāng)擴(kuò)大雙語課程范圍并增加學(xué)時[2]。

學(xué)生外語水平與雙語教學(xué)的沖突。目前，我國高校學(xué)生英語的聽說能力普遍較差，多數(shù)學(xué)生應(yīng)付日常的外語會話尚有很大困難，更不用說去難理解雙語講授的學(xué)科理論知識。我們應(yīng)該采取一些靈活機(jī)動的方式去實(shí)施雙語教學(xué)，比如，可以采取分類教學(xué)。根據(jù)學(xué)生的外語水平將學(xué)生分成不同的班級，對外語聽說能力較強(qiáng)的學(xué)生實(shí)施雙語教育。而對于外語基礎(chǔ)差、不能適應(yīng)雙語教育的學(xué)生不宜勉強(qiáng)，應(yīng)對其實(shí)施普通的母語教育[3]。

硬件條件不足與雙語教學(xué)的沖突。我國高校中的各種教學(xué)設(shè)施和教學(xué)條件都是為開展?jié)h語教學(xué)而設(shè)置的，而開展雙語教學(xué)所需要的教材、參考資料、音像資料、教具等條件幾乎很少有現(xiàn)成的，開展雙語教學(xué)的教師必須自己創(chuàng)造條件，開出一門雙語教學(xué)課程教師所付出的勞動遠(yuǎn)超出一般漢語課程。

微生物論文:現(xiàn)代臨床微生物學(xué)在感染控制中的作用

【關(guān)鍵詞】 微生物學(xué) 感染控制 作用

現(xiàn)代臨床微生物學(xué)是一門由臨床醫(yī)學(xué)、基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和預(yù)防醫(yī)學(xué)相結(jié)合的交叉學(xué)科，又是檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中重要和成熟的專業(yè)之一。這門新興的學(xué)科需要微生物醫(yī)師和實(shí)驗(yàn)技術(shù)人員聯(lián)合進(jìn)行工作，具體任務(wù)有四項(xiàng)：①對微生物標(biāo)本做出快速、的檢驗(yàn)報(bào)告，及時滿足臨床的需要；②進(jìn)行有關(guān)抗菌藥物耐藥性方面的各種試驗(yàn)，受理抗菌藥物合理應(yīng)用的咨詢；③密切結(jié)合臨床，與臨床醫(yī)師討論、研究及處理有關(guān)感染性疾病的問題；④參與抗菌藥物臨床合理應(yīng)用的管理和醫(yī)院感染監(jiān)測、控制和管理［1］。這就要求臨床微生物工作者不僅要完成實(shí)驗(yàn)室工作，還要完成有關(guān)的臨床工作，成為感染控制和抗菌藥物臨床應(yīng)用的參謀和顧問。

1 病原學(xué)診斷

1.1 病原學(xué)診斷的基本要求

1.1.1 確保臨床標(biāo)本:恰當(dāng)?shù)臉?biāo)本采集是感染性疾病診斷的最為重要的一個步驟。要求臨床醫(yī)師正確采集能代表感染部位的臨床標(biāo)本，廣泛采用保護(hù)性試子、合格的容器及安全運(yùn)送培養(yǎng)基，避免標(biāo)本中的微生物受毒性物質(zhì)作用而死亡。

1.1.2 了解機(jī)體的正常菌群：了解人體的正常菌群是細(xì)菌檢驗(yàn)的必要前提，要了解正常菌群的概念、分布和種類，條件致病菌與內(nèi)源性感染、菌群失調(diào)癥與二重感染的概念，既不要將所有標(biāo)本分離出來的細(xì)菌都當(dāng)成致病菌，也不能將正常寄居菌所導(dǎo)致的內(nèi)源性感染輕易放過。

1.1.3 三定一結(jié)合：分離鑒定時要做定性、定量和定位分析，并結(jié)合病情。要求根據(jù)臨床和標(biāo)本的具體情況確定檢驗(yàn)程序，選擇培養(yǎng)基及合適的鑒定試驗(yàn)。要判斷分離出的細(xì)菌是致病菌、條件致病菌、還是非致病菌（定性），同時要有一個細(xì)菌數(shù)量的大致估計(jì)，必要時進(jìn)行半定量和定量培養(yǎng)。在人體有菌部位分離的細(xì)菌，其意義大小要參考微生物的定性和定量分析作出判斷；如在無菌部位（如血液、腦脊液）分離出細(xì)菌，無論是何種微生物和數(shù)量多少，均具有重要意義（定位分析）。在進(jìn)行“三定”分析時，一定要結(jié)合病情，觀察是否與病情相符。

1.1.4 提供快速、的病原學(xué)診斷：在臨床醫(yī)師提供病人的臨床診斷信息和適當(dāng)?shù)呐R床標(biāo)本，并盡可能獲得流行病學(xué)資料的情況下，進(jìn)行微生物檢驗(yàn)和藥敏試驗(yàn)，要求及時、地分析檢驗(yàn)結(jié)果，為臨床提供的病原學(xué)診斷以便對病人作出恰當(dāng)?shù)奶幚怼１M管目前微生物的分離鑒定仍作為病原學(xué)檢測的金標(biāo)準(zhǔn)，但這種“以活菌生長”為基礎(chǔ)的傳統(tǒng)的細(xì)菌學(xué)鑒定方法速度較慢，不能適應(yīng)臨床的需要，要求以標(biāo)本的直接檢查為基礎(chǔ)，如形態(tài)、染色、抗原檢測及核酸檢測（核酸雜交、PCR和16SrRNA分析），檢測致病基因（致病島、毒力島）和耐藥基因。盡可能在快速診斷方面下工夫。

1.1.5 及時報(bào)告：要使實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)有效地轉(zhuǎn)化為臨床有用的信息，病原微生物診斷報(bào)告應(yīng)實(shí)行三段報(bào)告制度，即在涂片或培養(yǎng)陽性結(jié)果出現(xiàn)時、敏感試驗(yàn)結(jié)果出來時以及最終結(jié)果出來后都要及時報(bào)告。

1.1.6 加強(qiáng)質(zhì)量控制，增加檢驗(yàn)項(xiàng)目：臨床微生物室必須加強(qiáng)質(zhì)量控制，保障各種標(biāo)本的檢驗(yàn)質(zhì)量，為臨床提供依據(jù)，并滿足臨床需要的各種檢驗(yàn)項(xiàng)目。當(dāng)前臨床微生物實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)本單位的實(shí)際情況增加檢驗(yàn)項(xiàng)目，臨床要求關(guān)注的一些項(xiàng)目有：①呼吸道標(biāo)本的細(xì)菌學(xué)篩選和半定量培養(yǎng)方法；②呼吸道非典型病原體的檢測，包括衣原體、支原體和軍團(tuán)菌；③非結(jié)核分枝桿菌的培養(yǎng)和藥敏；④免疫抑制或器官移植患者特殊病原體的檢測，如巨細(xì)胞病毒，卡氏肺孢子菌等；⑤抗生素相關(guān)腹瀉的病原體（主要是艱難梭菌）的檢測；⑥侵襲性真菌的快速檢測和藥敏試驗(yàn)等。

2 密切聯(lián)系臨床，參與臨床會診和感染病例討論會

2.1 獲取臨床信息，做出及時、的微生物報(bào)告：臨床感染性疾病往往涉及多種病原體，沒有任何一個單一的試驗(yàn)?zāi)軌驒z出所有潛在病原體。因此，臨床信息是選擇試驗(yàn)方法的重要參考依據(jù)。臨床醫(yī)師在開化驗(yàn)單時應(yīng)寫明有關(guān)病人的推測性診斷，以便實(shí)驗(yàn)人員能據(jù)此選擇合理的檢驗(yàn)程序和試驗(yàn)方法，并能指導(dǎo)臨床正確采集恰當(dāng)?shù)臉?biāo)本；當(dāng)實(shí)驗(yàn)室開始有實(shí)驗(yàn)結(jié)果時，必須及時通知臨床醫(yī)師，以便讓他們重新評價(jià)診療方案。

2.2 疑難微生物報(bào)告的解釋與咨詢：近年來，不少感染性疾病特別是醫(yī)院感染的病原譜和藥敏譜發(fā)生很大變化。以往罕見的微生物頻頻出現(xiàn)在檢驗(yàn)報(bào)告單上，藥敏試驗(yàn)的方法、受試品種、結(jié)果解釋也有不少改變。臨床醫(yī)師常常難以正確理解和利用臨床微生物檢驗(yàn)資料。面對這一現(xiàn)狀，臨床微生物室應(yīng)積極與臨床溝通，幫助解決臨床醫(yī)師在判斷微生物檢驗(yàn)和藥敏結(jié)果報(bào)告單時的困難。指出正常菌群、污染菌和感染菌的鑒別與判斷少見菌或罕見菌的意義；培養(yǎng)陰性時的可能原因；藥敏試驗(yàn)結(jié)果的判斷標(biāo)準(zhǔn)和局限性；特殊耐藥細(xì)菌的耐藥特點(diǎn)等，必要時在報(bào)告上增加注解。

2.3 設(shè)置微生物醫(yī)師，作為臨床與微生物室溝通的橋梁：目前國外不少醫(yī)院均有臨床微生物專家或檢驗(yàn)醫(yī)師的會診、咨詢制度［2］。如檢驗(yàn)開始時發(fā)現(xiàn)圖涂片有問題，即由檢驗(yàn)醫(yī)師主動與臨床聯(lián)系，共同討論涂片所見的意義。每天微生物室的醫(yī)師與技師在一起看培養(yǎng)和藥敏結(jié)果，尤其是痰培養(yǎng)結(jié)果要與直接涂片核對，發(fā)現(xiàn)問題及時與病房聯(lián)系。建議臨床微生物室每日有一位醫(yī)師參加本院感染科、呼吸科或ICU的晨會，并回來向科內(nèi)醫(yī)師匯報(bào)有關(guān)感染病人情況。或定期派出醫(yī)師帶上有關(guān)檢驗(yàn)結(jié)果，參加一些臨床科室的感染問題討論會，具體解決感染癥的治療問題［3］。如定時參加ICU、腫瘤科、神經(jīng)外科、兒科等的討論會，對血培養(yǎng)陽性、腦脊液檢查陽性或嚴(yán)重?zé)齻腥镜牟∪耍⑸镝t(yī)師要主動去病房看望，參加治療方案討論。對菌血癥或膿毒血癥病人要協(xié)助找出原發(fā)癥灶。臨床微生物醫(yī)師巡視病人后要在病歷上記錄意見，必要時可與臨床的主管醫(yī)師、主任一起討論。各臨床科室如有感染問題可與臨床微生物室聯(lián)系，詢問檢驗(yàn)報(bào)告的意義或要求會診。微生物室每周召開一次感染病例討論會，討論感染病人的情況，交流發(fā)現(xiàn)的問題，并將臨床微生物室的意見與臨床科室進(jìn)行交流。微生物室醫(yī)師也要參與日常檢驗(yàn)工作，并接受臨床有關(guān)微生物學(xué)問題。

3 參與抗菌藥物臨床應(yīng)用的管理

合理應(yīng)用抗菌藥物，減少或避免耐藥菌株產(chǎn)生，是當(dāng)前抗感染領(lǐng)域的一大難題，臨床微生物室在抗生素合理使用中起重要作用［4］。首先要重視感染的病原學(xué)診斷。臨床醫(yī)師在使用抗菌藥物前，應(yīng)采集多份微生物學(xué)標(biāo)本做細(xì)菌培養(yǎng)和藥敏試驗(yàn)，微生物室則為臨床提供快速、的細(xì)菌檢驗(yàn)和藥敏結(jié)果。此外，微生物專家與臨床醫(yī)生密切聯(lián)系并參與患者的治療也是控制抗生素用量的重要方法。微生物專家應(yīng)參與醫(yī)院藥事委員會，參與制定抗生素使用指南、教育和培訓(xùn)、監(jiān)督和檢查等。這方面香港馬麗醫(yī)院的做法是由感染監(jiān)控護(hù)士負(fù)責(zé)走訪感染病例，發(fā)現(xiàn)抗菌藥物誤用或不合理應(yīng)用時，由微生物室主任出面向院長、當(dāng)事科室主任和當(dāng)事人反饋，取得較好效果。

4 參與醫(yī)院感染的監(jiān)測、控制和管理

我國《醫(yī)院感染管理規(guī)范》明確指出檢驗(yàn)科在醫(yī)院感染管理中應(yīng)履行以下職責(zé)：負(fù)責(zé)醫(yī)院感染常規(guī)微生物學(xué)的監(jiān)測；開展醫(yī)院感染病原微生物的培養(yǎng)、分離鑒定、藥敏試驗(yàn)及特殊病原體的耐藥性監(jiān)測，定期總結(jié)、分析向有關(guān)部門反饋，向全院公布；醫(yī)院感染流行或暴發(fā)時，承擔(dān)相關(guān)檢測工作。

臨床微生物實(shí)驗(yàn)室在醫(yī)院感染的監(jiān)測、控制和管理中的作用包括：①加強(qiáng)病原學(xué)監(jiān)測，作為判定醫(yī)院感染的基礎(chǔ)；②加強(qiáng)耐藥性監(jiān)測，以指導(dǎo)合理使用抗菌素；③加強(qiáng)環(huán)境、器械等微生物學(xué)調(diào)查，以達(dá)到衛(wèi)生學(xué)指標(biāo)要求；④保障醫(yī)院內(nèi)消毒、滅菌的質(zhì)量；⑤通過流行病學(xué)調(diào)查和細(xì)菌學(xué)分型試驗(yàn)，追蹤感染源并加以控制［5］。

4.1 加強(qiáng)監(jiān)測：臨床微生物室是醫(yī)院感染控制委員會的必然成員，微生物檢驗(yàn)在醫(yī)院感染的監(jiān)測中起重要作用。若在臨床微生物檢驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)有醫(yī)院感染問題，要及時與醫(yī)院感染控制部門、病房醫(yī)師和護(hù)士聯(lián)系，并注意發(fā)展動態(tài)。醫(yī)院感染中的一些特殊耐藥菌如GRE、MRSA、產(chǎn)ESBL腸桿菌科細(xì)菌等常通過交叉感染傳播，曲霉菌、軍團(tuán)菌等常在空調(diào)、供水系統(tǒng)、霧化裝置存在并導(dǎo)致感染，對可能攜帶這些致病菌的來源常規(guī)監(jiān)測并提醒臨床注意，通常可有效預(yù)防傳播擴(kuò)散并節(jié)省大量抗感染費(fèi)用［6，7］。

4.2 醫(yī)院感染的教育和培訓(xùn)：臨床微生物室要參與有關(guān)人員的醫(yī)院感染教育和培訓(xùn)工作。如講解臨床微生物標(biāo)本的采集、保存、運(yùn)送的要求和注意事項(xiàng)，對標(biāo)本采集前要求病人應(yīng)該做些什么準(zhǔn)備，采集標(biāo)本應(yīng)選擇什么時機(jī)、什么部位，每天采幾次、采多少量以及采樣部位應(yīng)該如何消毒等一系列問題進(jìn)行解釋；對人體常見的正常菌群、定植菌、污染菌和感染菌等內(nèi)容進(jìn)行培訓(xùn)；對各種細(xì)菌耐藥酶的檢測及其含義和在選用抗生素方面的意義與臨床進(jìn)行經(jīng)常性的溝通等等。可采用多種方法如講座、討論會、簡訊、墻報(bào)園地甚至參與查房等形式。也可以融合到醫(yī)院感染管理的繼續(xù)教育培訓(xùn)項(xiàng)目之中。

4.3 參與消毒隔離的管理：正確、科學(xué)地實(shí)施消毒與隔離技術(shù)對預(yù)防和控制醫(yī)院感染非常重要，正確地指導(dǎo)、監(jiān)查消毒隔離工作也是臨床微生物室的工作之一。當(dāng)發(fā)生醫(yī)院感染暴發(fā)流行或特殊耐藥細(xì)菌感染時，臨床微生物專業(yè)人員應(yīng)參與制定消毒隔離措施，對相關(guān)的人員管理、廢棄物的處理等環(huán)節(jié)提出微生物專業(yè)意見。

4.4 定期細(xì)菌耐藥性監(jiān)測結(jié)果：目前對許多感染性疾病的抗菌藥物選擇是經(jīng)驗(yàn)性的。但經(jīng)驗(yàn)用藥也需要循證醫(yī)學(xué)和流行病學(xué)資料的支持。建議將所有病原菌分離和藥敏的資料用WHONET軟件保存，定期細(xì)菌耐藥性監(jiān)測結(jié)果，隨時統(tǒng)計(jì)分析ICU等重點(diǎn)科室常見病原菌和耐藥狀況，對臨床經(jīng)驗(yàn)性選擇抗生素、提高重癥感染的救治成功率大有幫助。

4.5 通過分子分型技術(shù)控制醫(yī)院感染：常用的分子分型技術(shù)有PFGE、RAPD等。微生物實(shí)驗(yàn)室設(shè)置分子分型實(shí)驗(yàn)室，對及時發(fā)現(xiàn)和控制病原菌流行具有重大的意義。國外一些醫(yī)院的做法是對VRE等不常見的耐藥菌一經(jīng)發(fā)現(xiàn)即進(jìn)行分子分型，根據(jù)基因分型，判斷流行的可能性及范圍并采取相應(yīng)措施控制感染［8］。如某醫(yī)院對2個月時間內(nèi)自16個病人分離出的19株VRE進(jìn)行分型，結(jié)果顯示其中十四株為一個型別，其他為一個型別，高度提示VRE流行，經(jīng)調(diào)查分析，發(fā)現(xiàn)14名患者中11人有直接聯(lián)系。根據(jù)這些分析，采取了針對控制措施而中止了感染［9］。另一些醫(yī)院針對肺炎克雷伯菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、粘質(zhì)沙雷菌等感染流行問題，均通過分子分型而得到控制。據(jù)統(tǒng)計(jì)，微生物室成立分子分型實(shí)驗(yàn)室（設(shè)備及人員）的費(fèi)用為18,050美元，每年分子分型相關(guān)支出為400，000，美元，假設(shè)所有醫(yī)院（美國）都常規(guī)進(jìn)行分子分型，實(shí)驗(yàn)相關(guān)費(fèi)用達(dá)20億美元，但節(jié)省下來的治療醫(yī)院感染的費(fèi)用將超過5倍（100億）。

總之，筆者認(rèn)為：臨床微生物實(shí)驗(yàn)室在感染控制中發(fā)揮作用大小的關(guān)鍵：一是要走出實(shí)驗(yàn)室，加強(qiáng)與臨床的聯(lián)系；二是要立足本職，做好常規(guī)的臨床微生物檢驗(yàn)工作，努力提高標(biāo)本的培養(yǎng)陽性率，縮短結(jié)果的報(bào)告時間，提高檢驗(yàn)結(jié)果與臨床治療結(jié)果的符合率；三是要加強(qiáng)宣傳、教育培訓(xùn)，在醫(yī)務(wù)人員中普及臨床微生物學(xué)知識，并對檢驗(yàn)的結(jié)果作出合理的解釋，協(xié)助臨床正確閱讀和分析微生物檢驗(yàn)報(bào)告單，使微生物檢驗(yàn)結(jié)果和資料能及時有效地被臨床醫(yī)師所利用。

微生物論文:微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)在現(xiàn)代醫(yī)藥工業(yè)中的應(yīng)用

【關(guān)鍵詞】 微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)；,,,,生物催化；,,,,關(guān)鍵中間體

摘要： 對微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)在現(xiàn)代醫(yī)藥工業(yè)應(yīng)用上的獨(dú)特優(yōu)勢，特別是在手性藥物或藥物中間體制備、借助微生物轉(zhuǎn)化手段實(shí)施組合生物催化在新藥篩選方面發(fā)揮的積極作用進(jìn)行了闡述分析，并結(jié)合作者自身近年來在該技術(shù)領(lǐng)域的實(shí)踐和收獲對數(shù)個相關(guān)課題作了介紹。

關(guān)鍵詞： 微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)； 生物催化； 關(guān)鍵中間體

1 概述

在過去的30多年中，微生物轉(zhuǎn)化或酶轉(zhuǎn)化技術(shù)在有機(jī)化學(xué)合成領(lǐng)域中的嘗試不僅使理論研究獲得廣泛開展，在實(shí)際應(yīng)用方面也取得了長足的進(jìn)步。許多化學(xué)合成工藝相當(dāng)復(fù)雜的藥物、食品添加劑、維生素、化妝品和其它一些精細(xì)化工產(chǎn)品合成過程中的某些重要反應(yīng)，目前已經(jīng)能夠用微生物或酶轉(zhuǎn)化技術(shù)得以替代。在許多國外文獻(xiàn)中經(jīng)常能夠看到的描述這種技術(shù)的名詞有：microbial transformation、microbial conversion、biotransformation、biotransconversion和enzymation等［1，2］。微生物轉(zhuǎn)化的本質(zhì)是某種微生物將一種物質(zhì)(底物)轉(zhuǎn)化成為另一種物質(zhì)(產(chǎn)物)的過程，這一過程是由某種微生物產(chǎn)生的一種或幾種特殊的胞外或胞內(nèi)酶作為生物催化劑進(jìn)行的一種或幾種化學(xué)反應(yīng)，簡言之，即為一種利用微生物酶或微生物本身的合成技術(shù)。這些具有生物催化劑作用的酶大多數(shù)對其微生物的生命過程也是必需的，但在微生物轉(zhuǎn)化過程中，這些酶僅作為生物催化劑用于化學(xué)反應(yīng)。由于微生物產(chǎn)生的這些能夠被用于化學(xué)反應(yīng)的大多數(shù)生物催化劑不僅能夠利用自身的底物及其類似物，且有時對外源添加的底物也具有同樣的催化作用，即能催化非天然的反應(yīng)(unnatural reactions)，因而微生物轉(zhuǎn)化可以認(rèn)為是有機(jī)化學(xué)反應(yīng)中的一個特殊的分支。某種特殊的微生物能夠?qū)⒛撤N特定的底物轉(zhuǎn)化成為某種特定的產(chǎn)物，其本質(zhì)是酶的作用。因此，對酶轉(zhuǎn)化無需多作解釋，它與微生物轉(zhuǎn)化的差別僅在于：前者是一個單一的酶催化的化學(xué)反應(yīng)，而后者為了實(shí)現(xiàn)這一酶催化反應(yīng)，需要為微生物提供一個能夠生物合成這些酶的條件，因此，從這一角度來看，這似乎是真正的生物轉(zhuǎn)化。另外，盡管用于生物轉(zhuǎn)化的酶大多來自于微生物，但也可以是來自于動物和植物的酶。而對于一個具體的生物轉(zhuǎn)化來說，究竟是采用微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)，還是采用酶轉(zhuǎn)化技術(shù)，這要綜合考慮實(shí)現(xiàn)這一過程的諸多因素，如成本、環(huán)境、技術(shù)裝備和質(zhì)量要求等。在研究一個微生物(或酶)轉(zhuǎn)化過程時，需要仔細(xì)地考慮諸多方面的問題如：所用轉(zhuǎn)化底物的選擇、所用微生物對不同底物轉(zhuǎn)化能力的考察、轉(zhuǎn)化路線或轉(zhuǎn)化反應(yīng)的選擇等。其中最主要的是尋找適合于所設(shè)計(jì)轉(zhuǎn)化過程的微生物，以及如何來提高這種微生物的轉(zhuǎn)化能力，即提高這種酶活力。再則是發(fā)現(xiàn)一種新的酶或一種新的反應(yīng)以便為設(shè)計(jì)一個新的微生物轉(zhuǎn)化過程提供一條線索。為了尋找能夠適合作為生物催化劑的微生物酶，除了有必要對原來已知的一些重要的酶或反應(yīng)進(jìn)行重新評價(jià)外，一種更為有效的方法是篩選新的微生物菌株或酶［3～6］。用于微生物轉(zhuǎn)化的菌株或酶的篩選的范圍應(yīng)該盡可能地廣，因?yàn)橹聊壳盀橹挂呀?jīng)發(fā)現(xiàn)了3000余種能夠催化各種化學(xué)反應(yīng)的酶，其中有些酶的催化效果比化學(xué)催化劑好；另外，微生物的多樣性和其生理生化特性的多樣性(它們能夠修飾和降解許許多多有機(jī)化合物)，使我們有可能找到某種微生物或酶來催化某種特定的和所期望的化學(xué)反應(yīng)。

2 生物轉(zhuǎn)化與藥物開發(fā)的應(yīng)用

愈來愈多的研究表明，作為治療用藥物的外消旋體混合物有著不可避免的缺點(diǎn)，而美國FDA公布的手性藥物指導(dǎo)原則無疑加快了從頭開始開發(fā)單一異構(gòu)體藥物或利用外消旋體轉(zhuǎn)換技術(shù)從已有的藥物中開發(fā)單一異構(gòu)體藥物的步伐。手性藥物制備的關(guān)鍵技術(shù)是不對稱合成技術(shù)。多年來，有機(jī)化學(xué)工作者已經(jīng)研究開發(fā)了許多種用化學(xué)的方法進(jìn)行不對稱合成的技術(shù)，但近20多年來，很多長期從事化學(xué)合成研究的工作者對微生物和酶反應(yīng)發(fā)生了興趣，與此同時，很多長期從事微生物和酶的研究的工作者對如何將此應(yīng)用于有機(jī)合成發(fā)生了興趣，從而使生物催化轉(zhuǎn)化(biocatalytic transformation)成為一種進(jìn)行不對稱合成的重要技術(shù)。應(yīng)用生物催化轉(zhuǎn)化技術(shù)進(jìn)行不對稱合成與化學(xué)合成法相比較具有的優(yōu)越性有：1)轉(zhuǎn)化底物某一基團(tuán)的專一性強(qiáng)，即對不需要轉(zhuǎn)化的基團(tuán)無需保護(hù)；2)通過對用于某一轉(zhuǎn)化的微生物進(jìn)行菌種選育和轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化，可以得到極高的轉(zhuǎn)化率；3)生物催化轉(zhuǎn)化的反應(yīng)條件溫和且對環(huán)境的污染很小。特別是近年來DNA重組技術(shù)的應(yīng)用和新的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的開發(fā)應(yīng)用，使愈來愈多的原來使用化學(xué)方法進(jìn)行不對稱合成的化合物有可能被生物催化轉(zhuǎn)化的方法來替代［7～10］。利用生物轉(zhuǎn)化技術(shù)進(jìn)行手性藥物的開發(fā)主要進(jìn)行兩個方面的工作：一是進(jìn)行藥物關(guān)鍵中間體的制備，因?yàn)槔蒙锎呋D(zhuǎn)化方法制備對映體純化合物(enantiopure compounds)具有很大的吸引力，但試圖利用這種方法來完成所期望的復(fù)雜的有機(jī)合成往往是困難的，甚至是不可能的，而利用這種方法獲得某一關(guān)鍵中間體是切實(shí)可行的；另外，盡管用化學(xué)的方法能夠在實(shí)驗(yàn)室條件下獲得所需要的手性藥物，但往往是由于成本和技術(shù)問題難以實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。因此用化學(xué)生物化學(xué)的制備路線具有獨(dú)特的優(yōu)越性，即所謂的“綠色合成工藝”；二是進(jìn)行消旋化合物的生物拆分或轉(zhuǎn)化，得到單一構(gòu)型的藥物分子。表1為一些利用生物轉(zhuǎn)化制備手性藥物或關(guān)鍵中間體的實(shí)例［11］。

3 組合生物催化與新藥發(fā)現(xiàn)組合

生物轉(zhuǎn)化(催化)(combinatorial biocatalysis)，是指利用一種以上的具有特殊轉(zhuǎn)化功能的微生物或酶，對同一個母體化合物進(jìn)行組合轉(zhuǎn)化，以得到化學(xué)結(jié)構(gòu)的多樣性，它是從已知化合物中尋找新型衍生物以及從簡單化合物制備復(fù)雜化合物的有效手段。從某種角度講，它比化學(xué)合成的方法更為簡單和有效。這是一個新的研究領(lǐng)域。天然產(chǎn)物的多樣性和其結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，是存在于生物體內(nèi)大量酶的作用結(jié)果。生物體內(nèi)負(fù)責(zé)一系列重要生命活動的酶，在體外同樣具有相同的催化能力。因此，只要體外的催化環(huán)境與體內(nèi)相仿，則能夠?qū)崿F(xiàn)一系列復(fù)雜的，特別是用傳統(tǒng)化學(xué)合成方法難以實(shí)現(xiàn)的化學(xué)反應(yīng)。利用生物催化劑或化學(xué)合成酶催化相結(jié)合的方法，能夠大大地增加衍生物的多樣性，以及能夠有效地對復(fù)雜天然產(chǎn)物的結(jié)果修飾和從簡單的分子構(gòu)建新的化合物庫，在這過程中，往往能夠發(fā)現(xiàn)新的生理活性物質(zhì)。生物催化劑為擴(kuò)大組合化學(xué)提供了各種合成的可能性［1，11～13］。表2為一些由酶或微生物催化的典型反應(yīng)。利用生物催化發(fā)現(xiàn)先導(dǎo)化合物的優(yōu)越性在于：1)可能進(jìn)行反應(yīng)的范圍廣；2)能夠定向進(jìn)行區(qū)域選擇性和立體選擇性；3)不需基團(tuán)保護(hù)和脫保護(hù)，一步實(shí)現(xiàn)所需的反應(yīng)；4)在溫和和均一的條件下可容易地實(shí)現(xiàn)自動化和一步反應(yīng)的重現(xiàn)性；5)溫和的反應(yīng)條件保障了復(fù)雜易變的分子結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性；6)高的催化活性可以降低催化劑的用量；7)酶的固定化可以使催化劑反復(fù)和循環(huán)使用；8)生物催化劑可在環(huán)境中被降解。

4 近年來本中心開展的一些相關(guān)課題的進(jìn)展

近年來，上海來益生物藥物研究開發(fā)中心開始涉及微生物轉(zhuǎn)化課題的研究，特別是用微生物進(jìn)行植物甾醇邊鏈降解制備甾體藥物關(guān)鍵中間體的開發(fā)以及抗糖尿病新藥米格列醇和伏格列波糖的開發(fā)。

表1 利用生物轉(zhuǎn)化制備手性藥物或關(guān)鍵中間體的部分實(shí)例（略）

4.1 甾體類微生物轉(zhuǎn)化的研究甾體藥物包括激素類藥物和非激素類藥物：前者如性激素、類皮質(zhì)激素和蛋白同化激素等；后者有抗細(xì)菌和抗腫瘤藥物等。由于其不可取代的用途及治療適應(yīng)證不斷擴(kuò)大，甾體藥物越來越引起人們的重視。利用生物轉(zhuǎn)化技術(shù)進(jìn)行甾體藥物生產(chǎn)主要有植物甾醇的邊鏈切除，以得到關(guān)鍵中間體ADD和4AD，以及進(jìn)行立體選擇性的羥化反應(yīng)。(1)利用微生物轉(zhuǎn)化切除邊鏈，制備甾體藥物關(guān)鍵中間體ADD和4AD微生物對甾體邊鏈的裂解轉(zhuǎn)化是一個很慢的過程，因?yàn)榈孜锖彤a(chǎn)物的溶解性都很差，且底物傳遞至細(xì)胞的過程和產(chǎn)物傳出細(xì)胞的過程都很慢。因此，如何提高底物的溶解性一直是提高微生物轉(zhuǎn)化率的重要步驟。我們在微生物轉(zhuǎn)化菌株的菌種選育、轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化和轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的研究方面進(jìn)行了數(shù)年的研究工作［14～17］，最終已經(jīng)獲得了具有產(chǎn)業(yè)化價(jià)值的微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)，即以天然維生素E生產(chǎn)下腳料(含有混合植物甾醇)為底物制備甾體藥物關(guān)鍵中間體ADD和4AD的工業(yè)化路線。圖1所示為混合植物甾醇底物和ADD以及4AD的化學(xué)結(jié)構(gòu)。(2)利用微生物轉(zhuǎn)化選擇性羥基化，制備甾體藥物關(guān)鍵中間體11OHADD、11OH4AD，以及抗心衰新藥依普利酮關(guān)鍵中間體11OH坎利酮我們分別進(jìn)行了以ADD、4AD以及坎利酮為底物的微生物轉(zhuǎn)化菌株的篩選、選育，以及轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化等大量研究工作，最終獲得了具有產(chǎn)業(yè)化價(jià)值的微生物轉(zhuǎn)化制備工藝。圖2所示為11OHADD和11OH4AD的化學(xué)結(jié)構(gòu)。圖3所示為從坎利酮到11OH坎利酮的微生物轉(zhuǎn)化。(3)利用微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)，獲得多種4AD結(jié)構(gòu)類似物很多甾體藥物的關(guān)鍵中間體與4AD的結(jié)構(gòu)類似物有關(guān)，我們篩選了多種具有不同特性的微生物菌株對4AD進(jìn)行轉(zhuǎn)化，結(jié)果得到了一系列的4AD結(jié)構(gòu)類似物，如圖4所示［18］。(4)利用微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)，從植物混合甾醇直接生產(chǎn)睪酮在我們多年對植物甾醇微生物轉(zhuǎn)化邊鏈切除的研究過程中，發(fā)現(xiàn)了一個非常有意義的現(xiàn)象：即在經(jīng)過誘變處理的大量微生物轉(zhuǎn)化菌種中，發(fā)現(xiàn)了一株能夠直接將植物甾醇轉(zhuǎn)化成睪酮的菌株［19］。同時，轉(zhuǎn)化條件的改變能夠使睪酮的轉(zhuǎn)化率大大地提高。進(jìn)一步的研究表明，能夠?qū)⒅参镧薮贾苯愚D(zhuǎn)化成大量睪酮的微生物菌株，其17羰基還原酶的活性比較高，因而將已經(jīng)轉(zhuǎn)化的ADD和4AD中17位的羰基還原成為羥基，分別獲得睪酮和去氫睪酮，以及另外一個17位邊鏈發(fā)生改變的結(jié)構(gòu)類似物，如圖5所示。經(jīng)過大量的菌種選育工作和轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化工作，已經(jīng)獲得了一條利用微生物轉(zhuǎn)化直接從混合植物甾醇制備睪酮的工業(yè)化工藝路線。

圖1 底物混合植物甾醇和產(chǎn)物ADD以及4AD的化學(xué)結(jié)構(gòu)（略）

圖2 11OHADD和11OH4AD的化學(xué)結(jié)構(gòu)（略）

圖3 從坎利酮到11OH坎利酮的微生物轉(zhuǎn)化（略）

圖4 利用微生物轉(zhuǎn)化4AD得到的一系列結(jié)構(gòu)類似物（略）

圖5 睪酮和去氫睪酮的化學(xué)結(jié)構(gòu)（略）

4.2 降糖藥物米格列醇的研究開發(fā)米格列醇(miglitol)的發(fā)現(xiàn)源于對微生物發(fā)酵產(chǎn)物野尻霉素的研究，研究顯示該原來作為抗沙門氏菌的抗生素具有較強(qiáng)的α葡萄糖苷酶抑制作用，繼而成為及時個具有開發(fā)價(jià)值的淀粉酶抑制劑。1脫氧野尻霉素(1deoxynojirimycin)由野尻霉素還原而得，也可由多種鏈霉菌和芽孢桿菌產(chǎn)生，同樣具有糖苷酶抑制作用。N取代1脫氧野尻霉素具有更好的降糖效果，米格列醇就是其中之一。米格列醇的結(jié)構(gòu)與葡萄糖相似，能夠可逆地競爭性抑制假單糖α葡糖苷酶，減少單糖的代謝，降低在小腸的吸收。圖6所示為葡萄糖、1脫氧野尻霉素和米格列醇的化學(xué)結(jié)構(gòu)。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，有多種制備米格列醇的化學(xué)合成工藝。其中有以6脫氧6氨基山梨醇為原料，經(jīng)雷尼鎳催化還原后，再與環(huán)氧乙烷反應(yīng)而成。也可以先與環(huán)氧乙烷反應(yīng)后，再在鈀碳催化下還原制得。另外，也有多種利用生物轉(zhuǎn)化和化學(xué)合成相結(jié)合的方法，以及先用微生物發(fā)酵制備野尻霉素或1脫氧野尻霉素后再用化學(xué)合成的方法來制備米格列醇［20］。本中心研究開發(fā)的米格列醇制備工藝采用生物轉(zhuǎn)化與化學(xué)合成相結(jié)合的方法，簡要工藝流程如圖7所示。本制備工藝的關(guān)鍵是篩選具有高效氧化氨基葡萄糖的微生物菌株，以及能夠?qū)崿F(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的轉(zhuǎn)化工藝。

4.3 降糖藥物伏格列波糖的研究開發(fā)伏格列波糖(voglibose)是新一代的α葡糖苷酶抑制劑，最初是從某種放線菌培養(yǎng)液中發(fā)現(xiàn)的氨基糖類似物，口服后能競爭拮抗性地抑制腸道內(nèi)雙糖類水解酶(α葡糖苷酶)，延緩糖尿病患者餐后血糖的迅速上升從而抑制餐后高血糖。同時伏格列波糖明顯降低身體的脂肪量，肥胖的減輕使胰島素受體敏感性增加，進(jìn)而使空腹血糖逐漸明顯下降。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，伏格列波糖的制備除了通過全化學(xué)合成獲得外，還有以下幾條路線：一條路線是由有效霉素產(chǎn)生菌發(fā)酵，從發(fā)酵液中分離出大組分有效霉素A，經(jīng)生物轉(zhuǎn)化后得到關(guān)鍵中間體valienamine和validamine，再經(jīng)過化學(xué)合成即可得到終產(chǎn)物；或是從有效霉素發(fā)酵液中分離出小組分有效霉素G，生物轉(zhuǎn)化得到關(guān)鍵中間體valienamine和valiolamine，兩者經(jīng)適當(dāng)步驟的化學(xué)合成反應(yīng)后即可得到終產(chǎn)物；第二條路線是從有效霉素發(fā)酵液中分離出小組分valienamine，經(jīng)化學(xué)合成后得到終產(chǎn)物；第三條路線是從有效霉素發(fā)酵液中分離出小組分valiolone，同樣經(jīng)適當(dāng)化學(xué)合成反應(yīng)后得到終產(chǎn)物；第四條路線是由D葡萄糖經(jīng)一系列的化學(xué)反應(yīng)直接合成得到終產(chǎn)物。其流程如圖8所示。本研究中心利用及時條工藝路線，篩選獲得了具有高轉(zhuǎn)化效率的微生物菌株，以及適合工業(yè)化生產(chǎn)的轉(zhuǎn)化工藝。

圖6 米格列醇、野尻霉素及1脫氧野尻霉素、αD葡萄糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)（略）

圖7 米格列醇的制備工藝（略）

4.4 N乙酰神經(jīng)氨酸的研究開發(fā)N乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5Ac)是合成抗病毒藥物扎那米韋的前體，其本身也具有多種重要的應(yīng)用價(jià)值。目前有三種不同的生物轉(zhuǎn)化方法制備Neu5Ac(圖9)：途徑Ⅰ是一個相對簡單的醛縮反應(yīng)；途徑Ⅱ涉及到反應(yīng)前體ManNAc的磷酸化；途徑Ⅲ所合成的產(chǎn)物Neu5Ac9P需要進(jìn)一步用另外的酶脫磷酸化。這些合成方法均可在體外進(jìn)行，目前已經(jīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)的是途徑Ⅰ。

本中心采用途徑Ⅰ的生物轉(zhuǎn)化方法，首先從E.coliC600中成功地?cái)U(kuò)增了N乙酰神經(jīng)氨酸裂合酶基因(nal)，通過同源性比較發(fā)現(xiàn)，它與來源于E.coli K12的nal序列一致。氨基酸序列比對結(jié)果表明，136和164位的氨基酸也為賴氨酸和酪氨酸，與文獻(xiàn)報(bào)道的活性中心位點(diǎn)一致。進(jìn)而，將該基因通過EcoRI和BamHI兩個酶切位點(diǎn)，嚴(yán)格控制起始密碼子和啟動子間距離的情況下克隆到高表達(dá)載體pYG5上，構(gòu)建成新的質(zhì)粒pLY2，并進(jìn)行其表達(dá)研究。然后對粗酶的制備、轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化、分析檢測方法的建立，以及產(chǎn)物的分離純化等進(jìn)行了研究， 初步獲得了一條適合工業(yè)化生產(chǎn)N乙酰神經(jīng)氨酸的路線。

微生物論文:微生物次級代謝產(chǎn)物生物合成基因簇與藥物創(chuàng)新

【關(guān)鍵詞】 ,微生物次級代謝產(chǎn)物；,,生物合成基因簇；,,藥物創(chuàng)新；,,組合生物合成；,,代謝工程

摘要： 微生物產(chǎn)生眾多結(jié)構(gòu)和生物活性多樣的次級代謝產(chǎn)物，其生物合成基因簇的克隆是藥物創(chuàng)新和產(chǎn)量提高的必要前提。迄今為止已有超過150種生物合成基因簇通過各種方式被克隆，并被用于組合生物合成、體外糖類隨機(jī)化、代謝工程的定向改造。我們研究室已經(jīng)克隆并測定了氨基糖苷類井岡霉素/有效霉素、多烯類抗生素FR008/克念菌素、聚醚類南昌霉素、聚酮類梅嶺霉素、雜合聚酮多肽類口惡唑霉素等生物合成基因簇。深入的基因功能分析揭示了他們獨(dú)特的生物合成途徑和調(diào)節(jié)機(jī)理，為正在進(jìn)行的組合生物合成結(jié)構(gòu)改造和代謝工程產(chǎn)量提高奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： 微生物次級代謝產(chǎn)物； 生物合成基因簇； 藥物創(chuàng)新； 組合生物合成； 代謝工程

微生物產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物在化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物活性方面多種多樣，主要的產(chǎn)生菌類群包括放線菌、芽孢桿菌、粘細(xì)菌、假單胞菌、藍(lán)細(xì)菌、真菌等，其中已知抗生素的三分之二以上是以鏈霉菌為代表的放線菌產(chǎn)生的。根據(jù)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)可以基本上將抗生素分為β內(nèi)酰胺、氨基糖苷、核苷、四環(huán)素、多肽、糖肽、大環(huán)內(nèi)酯、安莎、聚醚和類萜等種類。以上多種多樣抗生素的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)也決定了它們生物活性的多樣性，除了可以抑菌殺菌外，還可以作為抗癌藥、抗寄生蟲藥、除草劑、酶抑制劑、免疫調(diào)節(jié)劑、受體拮抗劑、低血膽固醇治療劑等等，在醫(yī)療、工業(yè)、農(nóng)牧漁業(yè)和環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域均發(fā)揮著重要作用。隨著大量微生物次級代謝產(chǎn)物的分離，從自然界直接分離具有新結(jié)構(gòu)、新活性化合物變得越來越困難，已知結(jié)構(gòu)化合物分離的重復(fù)性很高。另一方面，臨床上病原微生物的耐藥性日益嚴(yán)重，伴隨著多耐藥性、高耐藥性病原菌以及艾滋病、SARS、禽流感等新型疾病不斷出現(xiàn)，如何利用已有資源，定向創(chuàng)造新結(jié)構(gòu)、新活性化合物以及提高微生物次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量，成為當(dāng)務(wù)之急。分子生物學(xué)基礎(chǔ)上的組合生物合成(combinatorial biosynthesis)［1］和代謝工程(metabolic engineering)［2］成為解決上述問題的重要手段，但是次級代謝產(chǎn)物生物合成基因(簇)的克隆與功能鑒定是這兩項(xiàng)技術(shù)實(shí)施的必要前提。

1 微生物次級代謝產(chǎn)物生物合成基因簇特點(diǎn)及總體研究進(jìn)展

1.1 微生物次級代謝產(chǎn)物生物合成基因簇的組成特點(diǎn)自從Malpartida等1984年克隆了放線紫紅素的全部生物合成基因［3］，以及隨后克隆的榴菌素［4］、紅霉素［5，6］、泰樂星等生物合成基因，揭示了微生物次級代謝產(chǎn)物生物合成基因成簇排列的特征，即與特定產(chǎn)物合成相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因、調(diào)節(jié)基因、耐藥性基因和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等集中位于染色體的一段連續(xù)區(qū)域。除此之外，微生物次級代謝產(chǎn)物生物合成基因簇還具有以下幾個特點(diǎn)：①生物合成基因一般形成幾個不同的轉(zhuǎn)錄單位；②通常含有一個以上的耐藥性基因，且耐藥性基因和結(jié)構(gòu)基因表達(dá)之間有一定的相互調(diào)節(jié)；③絕大多數(shù)基因表達(dá)的調(diào)控發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平，除了受特異的途徑專一性調(diào)節(jié)因子調(diào)控外，還受到同時影響胞內(nèi)其他產(chǎn)物合成甚至細(xì)胞分化的全局性調(diào)節(jié)因子的調(diào)控［7］。微生物次級代謝產(chǎn)物生物合成基因的成簇排列特征為相應(yīng)生物合成基因的克隆提供了方便，也就是說，幾乎任何一個結(jié)構(gòu)基因、耐藥性基因、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因或途徑專一性調(diào)節(jié)基因的克隆都有可能導(dǎo)致整個生物合成基因簇的獲得。

1.2 微生物次級代謝產(chǎn)物生物合成基因簇的克隆情況根據(jù)微生物次級代謝產(chǎn)物生物合成基因簇的上述特點(diǎn)，大量的生物合成基因簇從不同的微生物種群中克隆出來，其中主要的克隆方法有突變株回補(bǔ)(如放線紫紅素［3］)、利用同源性較高的異源DNA作為探針的雜交法(如榴菌素［4］)、耐藥性基因的克隆(如紅霉素［5］)、從蛋白質(zhì)分離到反推編碼DNA的反向遺傳(如利福霉素［8］)、根據(jù)同源蛋白保守區(qū)設(shè)計(jì)的兼并性引物擴(kuò)增法(如阿卡波糖［9］)以及整個生物合成基因簇的異源表達(dá)(如腸球菌素［10］)等。通過上述克隆方法，迄今為止已經(jīng)克隆了超過150種微生物次級代謝產(chǎn)物的生物合成基因簇，一方面進(jìn)一步證明了微生物次級代謝產(chǎn)物成簇排列的特點(diǎn)，另一方面也揭示了結(jié)構(gòu)上不同的代謝產(chǎn)物在編碼基因上的相關(guān)性，例如β內(nèi)酰胺類、多肽類、糖肽類都主要由非核糖體肽合酶(nonribosomal peptide synthase，NRPS)［11］負(fù)責(zé)合成，四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類、安莎類、聚醚類則由I型或II型聚酮合酶(polyketide synthase，PKS)［1］合成。因此根據(jù)編碼基因種類的不同，所有已克隆的生物合成基因簇可以按表1中所列的類別來歸類。

1.3 次級代謝產(chǎn)物生物合成基因簇資源的定向利用如此眾多生物合成基因簇的克隆為微生物次級代謝產(chǎn)物的比較研究打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。1985年Hopwood等將放線紫紅素的生物合成基因轉(zhuǎn)入榴菌素和麥德霉素產(chǎn)生菌獲得雜合抗生素［12］，標(biāo)志著微生物次級代謝產(chǎn)物組合生物合成技術(shù)的誕生，即通過將不同次級代謝產(chǎn)物合成基因在微生物間的相互交換產(chǎn)生非天然的基因組合，從而人為定向設(shè)計(jì)具有新結(jié)構(gòu)的次級代謝產(chǎn)物的遺傳操作過程。迄今為止，組合生物合成的理論基礎(chǔ)和技術(shù)儲備已經(jīng)相當(dāng)豐富，并且產(chǎn)生了數(shù)百種非天然的“天然產(chǎn)物”(nonnatural natural product)。2001年Thorson教授首先提出了將化學(xué)合成和酶催化進(jìn)行有機(jī)結(jié)合的體外糖類隨機(jī)化(in vitro glycorandomization，IVG)［13］的新概念，即把通過化學(xué)方法高效合成的多種自由糖基，在定向進(jìn)化產(chǎn)生的具有底物識別廣譜性糖基激酶、核苷轉(zhuǎn)移酶和糖基轉(zhuǎn)移酶的級聯(lián)催化下，在體外轉(zhuǎn)移到多種糖基受體，從而大量產(chǎn)生多種新結(jié)構(gòu)、新活性衍生物的過程。他們利用萬古霉素的糖基轉(zhuǎn)移酶GtfE和許多非天然的NDP糖基供體一次性獲得了32種攜帶有不同糖基的萬古霉素衍生物，充分顯示了該項(xiàng)技術(shù)的高效性和巨大潛力。微生物次級代謝產(chǎn)物完整生物合成基因簇的克隆和功能分析使得生物合成途徑及生物合成調(diào)控機(jī)理的闡明成為可能，從而揭示生物合成途徑的限速步驟和調(diào)控節(jié)點(diǎn)，并進(jìn)行相應(yīng)的遺傳操作來顯著提高次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量或提高活性組分的比例、降低消除低活性組分的含量。因此在基因簇克隆和遺傳分析基礎(chǔ)上的代謝工程研究也變得目的性更強(qiáng)、效率更高。例如，Malmberg等在利用棒狀鏈霉菌研究頭霉素C的生物合成過程中發(fā)現(xiàn)，控制從初級代謝產(chǎn)物賴氨酸向頭霉素前體α氨基己二酸轉(zhuǎn)化的賴氨酸ε氨基轉(zhuǎn)移酶(LAT)是頭霉素C生物合成的限速酶，額外拷貝LAT向棒狀鏈霉菌的引入致使頭孢霉素C的產(chǎn)量提高了2～5倍［14］。

2 上海交通大學(xué)分子微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的研究進(jìn)展

我們實(shí)驗(yàn)室長期從事重要的農(nóng)業(yè)、飼養(yǎng)業(yè)抗生素生物合成的研究，包括抗水稻紋枯病的井岡霉素和5102I號素、抗稻瘟病的慶豐霉素、抗玉米小斑病的5102II號素和靜絲霉素、 廣譜抗真菌多抗霉素、 抗雞球蟲病的南昌霉素、廣譜殺蟲活性的梅嶺霉素等。近年來我們也在抗真菌抗生素FR008/克念菌素、抗腫瘤和HIV口惡唑霉素、抗腫瘤安絲霉素的生物合成方面進(jìn)行了深入研究。

表1 已克隆的微生物次級代謝產(chǎn)物生物合成基因簇（略）

2.1 井岡霉素/5102I的生物合成氨基糖苷類井岡霉素是由吸水鏈霉菌井岡變種5008產(chǎn)生的重要農(nóng)用抗生素，是我國乃至東南亞防治水稻紋枯病的重要藥物，年產(chǎn)量已經(jīng)超過4萬噸。井岡霉素和有效霉素(validamycin)的結(jié)構(gòu)一致，即結(jié)合有一分子葡萄糖基的井岡胺/有效氧胺(validoxylamine)。井岡霉素的大面積使用使提高其產(chǎn)量(尤其是活性組分A組分的含量)，降低生產(chǎn)成本具有重要的意義。井岡霉素也是生產(chǎn)臨床上重要的治療糖尿病藥物伏格列波糖(vogliobose)和阿卡波糖的重要前體，其產(chǎn)量的提高和特異合成中間體的積累將顯著降低生產(chǎn)成本或簡化生產(chǎn)工藝。井岡霉素和阿卡波糖同屬于C7N氨基環(huán)醇類次級代謝產(chǎn)物，前期的化學(xué)喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)由7磷酸景天庚酮糖環(huán)化而成的2表5表有效醇酮是兩者生物合成途徑中共同的前體物，因此推斷催化該步反應(yīng)的環(huán)化酶基因應(yīng)該有較高同源性［15］。利用來自于游動放線菌SE50/110阿卡波糖生物合成基因簇的環(huán)化酶基因acbC為異源探針，我們在井岡變種5008的基因文庫中釣取了覆蓋約70kb染色體區(qū)域的陽性克隆，隨后該區(qū)域內(nèi)30kb大片段的缺失導(dǎo)致突變株喪失了合成井岡霉素的能力，直接證明了該區(qū)域同井岡霉素的生物合成直接相關(guān)［16］。對acbC同源環(huán)化酶基因valA兩側(cè)45kb區(qū)域的序列測定揭示了27個開放閱讀框(open reading frame,ORF)(白林泉等，待發(fā)表)，其中包括16個結(jié)構(gòu)基因，2個調(diào)節(jié)基因，1個轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，3個與轉(zhuǎn)座有關(guān)的基因，1個抗碲基因和其他4個未知基因(圖1)。通過基因的逐個敲除與回補(bǔ)我們確定了與井岡霉素A組分合成直接相關(guān)的8個結(jié)構(gòu)基因(valA, B,C,K,L,M,N,G)，而且這8個基因重新組裝后在變鉛青鏈霉菌1326中的異源表達(dá)也產(chǎn)生了井岡胺A和井岡霉素A。同時我們正在通過異源表達(dá)各個相關(guān)合成酶并進(jìn)行相關(guān)的體外催化活性分析。一方面直接證明了環(huán)化酶ValA能夠環(huán)化7磷酸景天庚酮糖生成2表5表有效醇酮，另一方面糖基轉(zhuǎn)移酶ValG催化一分子的葡萄糖轉(zhuǎn)移到井岡胺上從而生成最終產(chǎn)物井岡霉素A，而且UDP葡萄糖是的糖基供體。而對激酶ValC的體外催化分析發(fā)現(xiàn)井岡霉素生物合成的中間產(chǎn)物有效烯酮和有效酮為最適底物， 明顯不同于阿卡泊糖生物合成基因簇種的同源蛋白AcbM的功能，AcbM催化2表5表有效醇酮的磷酸化(章亦榮等，待發(fā)表)。井岡霉素生物合成基因簇的克隆、序列測定和初步功能分析為其生物合成途徑的最終闡明奠定了基礎(chǔ)，同時調(diào)節(jié)基因和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因的發(fā)現(xiàn)也為井岡霉素產(chǎn)量的提高提供了最理想的改造靶點(diǎn)。另外初步分析顯示，8個必需基因之外的其他結(jié)構(gòu)基因很可能與井岡霉素其他組分的合成相關(guān)，因此這些基因功能的闡明有利于消除各種次級組分的積累、顯著提高活性組分井岡霉素A的積累。最近我們在吸水鏈霉菌應(yīng)城變種1022中克隆和測定了5102I號素的生物合成基因簇。與井岡霉素生物合成基因簇相比，5102I號素的生物合成基因簇中結(jié)構(gòu)基因的排列發(fā)生了很大變化，而且也缺少相應(yīng)的調(diào)節(jié)基因，這可能是5102I號素產(chǎn)量很低的原因(蹇曉紅等，待發(fā)表)。兩個相似抗生素生物合成基因簇的克隆為該類次級代謝產(chǎn)物的比較研究和定向改造提供了良好素材。實(shí)現(xiàn)井岡霉素在水稻等植物中的表達(dá)、直接抵抗水稻紋枯病等真菌病害的侵染也是本項(xiàng)研究的目標(biāo)之一，相關(guān)工作正在開展,跨學(xué)科的合作研究也在醞釀之中。

圖1 井岡霉素/有效霉素的生物合成基因簇（略）

2.2 抗生素FR008/克念菌素的生物合成38元七烯大環(huán)內(nèi)酯類聚酮化合物抗生素FR008是由鏈霉菌FR008產(chǎn)生的，結(jié)構(gòu)上同克念菌素(candicidin)一致，具有抗真菌和殺滅蚊子幼蟲的活性，臨床上多用于念球菌陰道炎的治療，還可通過降低膽固醇，減輕前列腺增生癥。因?yàn)榭股谾R008結(jié)構(gòu)中帶有來自于對氨基苯甲酸的對氨基苯乙酮成色基團(tuán)，所以我們利用來自于克念菌素產(chǎn)生菌灰色鏈霉菌的對氨基苯甲酸合成酶為異源探針，在國際上首次克隆了多烯類聚酮化合物的生物合成基因簇，即抗生素FR008的生物合成基因簇，并通過基因中斷實(shí)驗(yàn)證實(shí)該區(qū)域跨越150kb以上［17］。最終對總共1498kb區(qū)域的序列測定揭示了21個可能的相關(guān)基因(圖2)［18］，其中有6個基因編碼巨大的成模塊組織(modular)的聚酮合酶fscAF，共編碼21個模塊，這與抗生素FR008骨架合成所需的21步縮合反應(yīng)是非常一致的，而且在結(jié)構(gòu)域水平上揭示了七烯共軛結(jié)構(gòu)形成了分子基礎(chǔ)。基因簇序列分析還發(fā)現(xiàn)了與起始單位對氨基苯甲酸合成相關(guān)的基因(pabAB和pabC)、與海藻糖胺(mycosamine)糖基合成相關(guān)的基因(fscMII和fscMIII)、與糖基化和羧化等后修飾反應(yīng)相關(guān)的基因(fscMI、fscP和fscO)。同時還發(fā)現(xiàn)了四個調(diào)節(jié)基因和兩個轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，有利于提高抗生素FR008的產(chǎn)量。根據(jù)對抗生素FR008生物合成基因簇的生物信息學(xué)分析，我們提出了抗生素FR008復(fù)合物中四種主要組分的分子轉(zhuǎn)換模式［18］，近期的研究成果表明這種推斷是正確的，而且獲得了只積累主要活性組分II號組分的工程菌株(周永軍等，待發(fā)表)。通過對糖基轉(zhuǎn)移酶基因的失活獲得了一系列缺失了糖基的新衍生物，并可以初步推斷出糖基的轉(zhuǎn)移發(fā)生在羧化反應(yīng)之后，是后修飾反應(yīng)的一步。而對海藻糖胺合成相關(guān)的轉(zhuǎn)氨酶基因fscMII的敲除獲得了糖基上缺少氨基的一系列衍生物，顯示了糖基轉(zhuǎn)移酶FscMI相對的底物廣譜性。

圖2 抗生素FR008/克念菌素的生物合成基因簇（略）

2.3 南昌霉素的生物合成酸性脂溶性聚醚抗生素南昌霉素由南昌鏈霉菌產(chǎn)生，是鈉離子載體，具有很強(qiáng)的抗雞球蟲病活性，而且安全無毒。產(chǎn)量低是限制南昌霉素推廣使用的主要因素，因此需要克隆其生物合成基因簇，尋找生物合成途徑的限速步驟、調(diào)節(jié)基因或轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，通過定向的遺傳改良從根本上提高其產(chǎn)量。由于聚醚骨架的生物合成遵循I型聚酮合酶的催化機(jī)制，因此我們利用紅霉素生物合成基因簇的PKS結(jié)構(gòu)域?yàn)楫愒刺结樤谀喜溍咕幕蛭膸熘嗅炄×?0個陽性克隆，并且經(jīng)過染色體步移歸為8個獨(dú)立的重疊群(contig AH)，暗示該菌株可能編碼至少8個聚酮生物合成基因簇［19］，這與天藍(lán)色鏈霉菌［20］和除蟲鏈霉菌［21］的基因組全序列測定揭示的鏈霉菌的基因組復(fù)雜性是一致的。進(jìn)一步的大片段缺失實(shí)驗(yàn)確定了重疊群A負(fù)責(zé)南昌霉素的生物合成，在此基礎(chǔ)上的1325kb區(qū)域的序列測定發(fā)現(xiàn)了30個ORF(圖3)［22］， 其中與聚酮鏈合成相關(guān)的基因有11個(nanA1A11)，編碼14個模塊74個結(jié)構(gòu)域，而且nanA1A6可能形成一個長達(dá)564kb的轉(zhuǎn)錄單位。很特別的是nan9編碼的模塊13中只含有酮基還原酶KR和酰基轉(zhuǎn)移酶AT結(jié)構(gòu)域，而缺少酰基載體蛋白ACP結(jié)構(gòu)域，不過下游的nan10則編碼一個獨(dú)立的ACP，因此兩者可能是協(xié)同作用的。在南昌霉素生物合成基因簇中并沒有發(fā)現(xiàn)在其他聚酮生物合成基因簇中負(fù)責(zé)聚酮鏈釋放的硫酯酶TE結(jié)構(gòu)域或基因，但是初步的生物信息學(xué)分析顯示在一個延伸模塊(模塊14)的末端有一個與酯酶同源的結(jié)構(gòu)域CR，很可能通過一種不同的釋放機(jī)制來釋放線性的聚酮鏈，相關(guān)的研究正在進(jìn)行之中。聚醚類次級代謝產(chǎn)物在聚酮鏈形成后要經(jīng)過一系列氧化、異構(gòu)等級聯(lián)反應(yīng)機(jī)制形成聚醚結(jié)構(gòu)，在南昌霉素生物合成基因簇中異構(gòu)酶NanI、環(huán)氧化酶NanO和環(huán)氧化物水解酶NanE很可能在聚酮鏈還沒有從聚酮合成酶上釋放之前催化聚醚結(jié)構(gòu)的形成。另外，南昌霉素的生物合成途徑還包括羥化、糖基化過程，相應(yīng)的羥化酶基因nanP和糖基轉(zhuǎn)移酶基因nanG5也在基因簇中找到，而且負(fù)責(zé)糖基4Omethylrhodinose生物合成的所有基因也在基因簇中存在。在南昌霉素生物合成基因簇中存在7個調(diào)節(jié)基因和2個轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因，暗示南昌霉素的生物合成具有復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制，并很可能是導(dǎo)致南昌霉素產(chǎn)量較低的主要原因。對相應(yīng)調(diào)節(jié)基因功能的闡明以及在此基礎(chǔ)上的遺傳操作將會成為產(chǎn)量提高的突破口。另外整個基因組中8個聚酮生物合成基因簇的存在也顯示了對共同前體乙酰輔酶A和丙酰輔酶A的競爭，因此其他聚酮生物合成基因簇的敲除應(yīng)該會導(dǎo)致南昌霉素的產(chǎn)量提高。對重疊群C的缺失的確導(dǎo)致了南昌霉素產(chǎn)量的明顯提高(孫宇暉等，待發(fā)表)。

圖3 南昌霉素生物合成基因簇（略）

2.4 梅嶺霉素的生物合成南昌鏈霉菌同時產(chǎn)生梅嶺霉素，它是一種與avermectin骨架結(jié)構(gòu)相似的16元大環(huán)內(nèi)酯抗生素(圖4)，具有甚至比avermectin還要強(qiáng)的抗寄生蟲活性。除了缺少齊墩果糖側(cè)鏈外，梅嶺霉素的主要組分還缺少C5位的甲基化，不過梅嶺霉素在C4位上攜帶有3甲基2烯丁酸側(cè)鏈。與avermectin結(jié)構(gòu)和生物活性上的異同點(diǎn)為我們定向改造梅嶺霉素或avermectin提供了切入點(diǎn)，如次級組分的消除、依維菌素的直接產(chǎn)生等等。根據(jù)avermectin生物合成基因簇的細(xì)胞色素P450羥化酶基因aveE、酮基還原酶基因aveF和硫酯酶結(jié)構(gòu)域基因aveTE保守序列設(shè)計(jì)同源引物，分別在南昌鏈霉菌中擴(kuò)增出了相應(yīng)基因片段，測序后發(fā)現(xiàn)相互間的核酸同源性分別為706%、659%和757%。利用上述擴(kuò)增片段為探針進(jìn)行的雜交初步顯示重疊群H負(fù)責(zé)梅嶺霉素的生物合成，在該區(qū)域的大片段缺失則導(dǎo)致了梅嶺霉素產(chǎn)生能力的徹底喪失［23］。最近完成的該基因簇部分區(qū)域的序列測定結(jié)構(gòu)顯示，梅嶺霉素和avermectin在PKS區(qū)域的基因排列、模塊組織形式、調(diào)節(jié)基因等有著高度的相似性，同時也揭示了兩者結(jié)構(gòu)差異的分子基礎(chǔ)，為進(jìn)一步的定向改造指明了方向(劉天罡等，待發(fā)表)。

2.5 其他微生物次級代謝產(chǎn)物生物合成基因的克隆實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)克隆的微生物次級代謝產(chǎn)物生物合成基因簇還有抗腫瘤抗生素口惡唑霉素的生物合成基因簇，它是由白色鏈霉菌產(chǎn)生的一種聚酮多肽復(fù)合物，很可能以口惡唑環(huán)作為合成的起始單位(圖5)。根據(jù)結(jié)構(gòu)推測，口惡唑霉素合成中的未知延伸單位(unknown extender unit)可能來自于甲氧基丙二酸單酰ACP(methoxymalonylACP)。 根據(jù)該延伸單位合成基因的保守性設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)兼并性引物在白色鏈霉菌中擴(kuò)增出同源片段，進(jìn)一步的基因敲除實(shí)驗(yàn)證實(shí)該段序列的確參與口惡唑霉素的生物合成(趙春華等，待發(fā)表)。利用該段DNA為探針也在白色鏈霉菌基因文庫中釣到了覆蓋135kb區(qū)域的陽性克隆，相關(guān)的序列測定和功能分析正在進(jìn)行之中。其他正在克隆的生物合成基因簇有廣譜抗真菌的多抗菌素、抗稻瘟病慶豐霉素、5102II號素等等。

圖4 梅嶺霉素與avermectin的結(jié)構(gòu)比較及avermectin的生物合成基因簇（略）

3 小結(jié)

多種微生物次級代謝產(chǎn)物生物合成途徑的克隆、序列測定、基因功能分析和組合生物合成探索，使我們初步構(gòu)建了微生物次級代謝產(chǎn)物基因工程操作平臺。一方面生物合成途徑和調(diào)控機(jī)理的闡明為提高次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量、定向提高活性組分成為可能，另一方面大量基因資源、遺傳操作體系、基因操作原理、產(chǎn)物分離系統(tǒng)的積累與優(yōu)化，為在研次級代謝產(chǎn)物的進(jìn)一步結(jié)構(gòu)和活性的組合生物合成改造鋪平了道路。本基因操作平臺的構(gòu)建也形成了一個開放體系，可以為接納并程序化其他次級代謝產(chǎn)物的研究與創(chuàng)新，并且為其他微生物次級代謝產(chǎn)物研究單位提供經(jīng)驗(yàn)和支持。

微生物論文:微生物及其基因呼喚專利法保護(hù)

二十一世紀(jì)，世界生物技術(shù)的發(fā)展突飛猛進(jìn)，隨之也引發(fā)了一系列法律上的新問題。分析微生物及其基因是專利法意義上的發(fā)明還是科學(xué)發(fā)現(xiàn)？探討其是否具備專利法保護(hù)所應(yīng)具備的條件，了解發(fā)達(dá)國家加強(qiáng)生物技術(shù)專利保護(hù)的國際慣例，對我國的生物技術(shù)專利保護(hù)具有重要意義。

近年來，生物技術(shù)的發(fā)展取得了驚人的進(jìn)步，在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、化工、環(huán)保等一系列領(lǐng)域引發(fā)了巨大的變革。科學(xué)家預(yù)言二十一世紀(jì)是生物技術(shù)的世紀(jì)，但是，非技術(shù)領(lǐng)域發(fā)展的落后使生物技術(shù)的先進(jìn)性未能充分發(fā)揮。原先的政治、經(jīng)濟(jì)、醫(yī)學(xué)、倫理道德、法律制度體系所處的制度環(huán)境因?yàn)樯锛夹g(shù)的發(fā)展而發(fā)生了重大的改變，而原先建立起來的理論體系、操作系統(tǒng)卻無法像生物技術(shù)的發(fā)展一樣在短期內(nèi)迅速實(shí)現(xiàn)體系的裂變、轉(zhuǎn)型、升級。生物技術(shù)就像一把雙刃劍，在帶給人們無限驚喜的同時，也帶給了人們無限的苦惱。

在法學(xué)界，生物技術(shù)及其專利性問題，一直是困擾學(xué)者們的重大難題。對于活的生物體及DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的描述主張專利權(quán)利，也引發(fā)了一系列激烈的爭論，對這個問題的探討已經(jīng)涉及到了專利制度的本質(zhì)以及發(fā)明和科學(xué)發(fā)現(xiàn)的界定、科技和倫理等一系列深層次問題。

微生物及其基因?qū)＠Ｗo(hù)紛爭

根據(jù)傳統(tǒng)專利法的觀點(diǎn)，要解決能否就微生物及基因主張專利權(quán)利的問題，關(guān)鍵在于微生物及基因應(yīng)屬于專利法上的發(fā)明還是科學(xué)發(fā)現(xiàn)。一般而言，發(fā)現(xiàn)是對自然現(xiàn)象本質(zhì)規(guī)律的揭示，而發(fā)明則是這些本質(zhì)規(guī)律的具體應(yīng)用。科學(xué)發(fā)現(xiàn)雖然可能較之發(fā)明對社會的貢獻(xiàn)更大，但其不具備專利法給予專利保護(hù)所要求的實(shí)用性，不能直接制造出前所未有的產(chǎn)物或直接當(dāng)作某種方法使用，故不是專利法意義上的發(fā)明，不能授予專利權(quán)。也就是說，一項(xiàng)重要的科學(xué)發(fā)現(xiàn)可能會對人類產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響，可能會獲得諾貝爾獎，但是卻不會成為專利法上所稱的發(fā)明而獲得專利保護(hù)。

對微生物及基因的研究成果到底歸屬于發(fā)明還是科學(xué)發(fā)現(xiàn)的不同回答，形成了微生物及基因能否進(jìn)行專利保護(hù)的兩種不同觀點(diǎn)。

一種觀點(diǎn)我們可以稱為否定說，認(rèn)為微生物及基因是自然界中客觀存在的，人們對其研究的成果恰如門捷列夫根據(jù)元素周期的深刻洞悉而繪出的元素周期表，或醫(yī)學(xué)科研人員憑借對人體的細(xì)微研究而畫出的人體解剖圖，當(dāng)然付出了艱苦卓絕的腦力勞動，但是仍屬于科學(xué)發(fā)現(xiàn)的范疇，因?yàn)榭茖W(xué)發(fā)現(xiàn)本身就決定了不可能是顯而易見就得出結(jié)論的，因此，對于微生物及基因本身，任何人都不可主張專利權(quán)利。但是，對其進(jìn)行提純、凈化、繪制的獨(dú)特方法卻屬于專利法的保護(hù)范圍，對其可以申請專利。

另一種觀點(diǎn)我們可以稱之為肯定說，認(rèn)為發(fā)明人主張權(quán)利的微生物及基因已經(jīng)因?yàn)榘l(fā)明人的提純、凈化、繪制活動而使其改變了原來自然存在的狀態(tài)。由于生物科技與社會生活的緊密聯(lián)系性，對微生物及基因的研究已不僅僅是對其客觀規(guī)律的揭示，它與客觀應(yīng)用僅有一步之遙。況且，基因研究比較特殊，高風(fēng)險(xiǎn)，高投入，商業(yè)應(yīng)用前景又不可估量，無論是從智慧勞動的角度還是從商業(yè)回報(bào)的角度，都應(yīng)該承認(rèn)其知識產(chǎn)權(quán)，授予專利權(quán)利，否則會使作為新興產(chǎn)業(yè)的生物科技的發(fā)展受到很大影響。

筆者認(rèn)為，在微生物及基因的研究成果的形成過程中，科學(xué)發(fā)現(xiàn)和發(fā)明兩者是兼而有之的，應(yīng)該對其進(jìn)行區(qū)別對待。

首先，不可否認(rèn)，微生物及基因是客觀存在于自然界中的，這并不以我們對其認(rèn)識多少為轉(zhuǎn)移，首次觀察到他們的存在應(yīng)該是一種對客觀事物的揭示，是一種科學(xué)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)然這種發(fā)現(xiàn)也不具有專利法保護(hù)所要求的工業(yè)實(shí)用性標(biāo)準(zhǔn)。所以，即使科研人員為此耗費(fèi)了畢生的精力，也不能因此主張專利權(quán)利，這就像科研人員觀察、測算到了某個宇宙天體的客觀存在但卻不能主張專利權(quán)利收取專利費(fèi)用一樣。

其次，如果研究進(jìn)一步深入，科研人員對微生物及基因進(jìn)行一系列的分離、提純、凈化，改變它在自然界天然的存在方式和狀態(tài)，使其能為人力所控制，并發(fā)掘出它為社會所利用的價(jià)值，那么我們就沒有理由拒絕為其提供專利法上的保護(hù)了。

其實(shí)，科學(xué)發(fā)現(xiàn)和發(fā)明在科技研究中是緊密結(jié)合的。任何一項(xiàng)科技發(fā)明活動，都必須以原來的科學(xué)發(fā)現(xiàn)為基礎(chǔ)，沒有任何一項(xiàng)發(fā)明是憑空產(chǎn)生的，只有熟練掌握該領(lǐng)域的客觀事物和規(guī)律，才能談得上發(fā)明創(chuàng)新。在生物技術(shù)的科研領(lǐng)域中當(dāng)然也是這樣，只不過由于生物技術(shù)研發(fā)本身所具有的高度專業(yè)性和連續(xù)性，微生物及基因的首次發(fā)現(xiàn)者和深層研發(fā)利用者往往是同一研究主體。這種發(fā)展現(xiàn)狀使得發(fā)明和科學(xué)發(fā)現(xiàn)連為一體，互相交織，相互作用，真假難辨。簡單地講，沒有對客觀規(guī)律的揭示或微生物、基因的首次發(fā)現(xiàn)，就不可能有生物技術(shù)的相關(guān)發(fā)明，但是，僅僅是客觀揭示和首次發(fā)現(xiàn)而請求專利法的保護(hù)又是不夠的。這其中，科研人員要做的是將兩者結(jié)合起來，搞出生物科技發(fā)明成果。我們要做的是將兩者分離開來，予以不同的法律態(tài)度。

我國生物技術(shù)專利法保護(hù)的現(xiàn)狀及對策

我國生物技術(shù)的專利保護(hù)起步晚于國外發(fā)達(dá)國家，在現(xiàn)行的專利法中沒有生物技術(shù)專利保護(hù)的法律規(guī)定。但在專利法實(shí)施細(xì)則中，有關(guān)于生物材料的樣品提交以及分類保藏的具體要求。審查指南中，也有對如何確定一類微生物是否具備專利保護(hù)條件的判斷標(biāo)準(zhǔn)：“未經(jīng)人類的任何技術(shù)處理而存在于自然界的微生物由于屬于科學(xué)發(fā)現(xiàn)，且不具有工業(yè)實(shí)用性，所以不授予專利權(quán)。只有當(dāng)微生物經(jīng)過分離成為純培養(yǎng)物，并且具有特定的工業(yè)用途時，微生物本身才是授予專利的主體”。

應(yīng)該說，我國關(guān)于生物技術(shù)專利保護(hù)的立法是和TRIPS的相關(guān)保護(hù)思想相一致的，對工作人員在實(shí)際操作中是否給予某項(xiàng)生物技術(shù)以專利保護(hù)提供了法律依據(jù)，對于發(fā)展我國的生物技術(shù)具有積極的現(xiàn)實(shí)意義。

我們不難發(fā)現(xiàn)，在我國生物技術(shù)的法律保護(hù)中，再去爭論微生物及基因在發(fā)明、科學(xué)發(fā)現(xiàn)中的歸屬以及是否給予其專利保護(hù)的問題已經(jīng)沒有太大意義。發(fā)達(dá)國家的生物技術(shù)在寬松的法律環(huán)境和強(qiáng)大的政府支持下得以迅速發(fā)展，作為生物技術(shù)發(fā)源地的美國，目前已擁有全世界三分之二強(qiáng)的生物技術(shù)公司，其中光是大的生物制藥公司就有225家，工業(yè)投資350億美元，可以說對生物技術(shù)寬松的法律支持已經(jīng)在為而且會繼續(xù)為美國創(chuàng)造巨大的財(cái)富。隨著發(fā)展中國家和發(fā)達(dá)國家在生物技術(shù)上的差距日益加大，運(yùn)用生物技術(shù)的斷優(yōu)勢掠奪全球有限的生物技術(shù)資源的“生物海盜行為”會越來越多。在發(fā)達(dá)國家搶灘登陸建立生物技術(shù)上的專利壁壘以取代被逐漸拆除的關(guān)稅壁壘的時候，發(fā)展中國家所能做的不是沉浸于到底要不要保護(hù)的學(xué)理爭論之中，而是從維護(hù)本國利益出發(fā)，在科研實(shí)力、法律保護(hù)上奮起直追，跟上國際知識產(chǎn)權(quán)保護(hù)的步伐，真正地學(xué)會用知識產(chǎn)權(quán)的武器維護(hù)自己的正當(dāng)利益，免受他國的“惡意侵害”。無論是從公共健康、商業(yè)利益出發(fā)，還是從科技進(jìn)步、社會發(fā)展考慮，生物技術(shù)的專利保護(hù)都勢在必行。

當(dāng)前，較大限度地利用現(xiàn)有優(yōu)勢，加快生物技術(shù)專利的國際保護(hù)進(jìn)程，在專利的國際申請中，充分利用國際條約中的外國優(yōu)先權(quán)制度，爭取以最快的時間在國際上搶占先機(jī)已是當(dāng)務(wù)之急。

1967年修訂的保護(hù)工業(yè)產(chǎn)權(quán)巴黎公約規(guī)定：“已在一個本同盟成員國正式提出過一項(xiàng)發(fā)明專利、一項(xiàng)實(shí)用新型、一項(xiàng)工業(yè)品式樣或一項(xiàng)注冊商標(biāo)的申請人或其他權(quán)利繼承人，在下列規(guī)定的期限內(nèi)在其他本同盟成員國提出同樣的申請時享有優(yōu)先權(quán)。”上述優(yōu)先權(quán)期限，對于發(fā)明專利和實(shí)用新型，規(guī)定為12個月，對工業(yè)品式樣和商標(biāo)規(guī)定為6個月。簡單地講，就微生物及基因的專利保護(hù)而言，在12個月以內(nèi)，專利申請人在巴黎公約其他締約國提出的專利申請以他在本國首次提出的專利申請日期作為判斷新穎性的時間標(biāo)準(zhǔn)。這種優(yōu)先權(quán)利的取得要以申請人在本國規(guī)定的最遲期限內(nèi)作出聲明作為形式要件。

12個月的時間對于人類社會的發(fā)展來說只是短短的一瞬，但是對于發(fā)展速度突飛猛進(jìn)的生物技術(shù)來講可能意味著天翻地覆的變化。生物技術(shù)的發(fā)展正在體現(xiàn)出“強(qiáng)者愈強(qiáng)，弱者愈弱”的態(tài)勢。我國如果不能搶得先機(jī)，就會受到各種不公平的待遇，發(fā)展的成本就會成倍地增長。