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植物組織培養(yǎng)論文:植物組織培養(yǎng)褐變產(chǎn)生探究論文

論文關(guān)鍵詞:植物組織培養(yǎng)褐變酚類物質(zhì)多酚氧化酶醌類物質(zhì)

論文摘要:植物組織培養(yǎng)過程中，褐變問題普遍存在,與菌類污染和玻璃話現(xiàn)象并稱為植物組織培養(yǎng)的三大難題。針對褐變難題，本文結(jié)合相關(guān)資料，對影響褐變的因素作了分析，褐變的影響因素是復(fù)雜的，隨植物種類外植體的部位幾生理狀況培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的不同而危害的程度有所不同，對這些因素是內(nèi)因外界影響作用作了分析并針對這些因素提出了相應(yīng)的解決措施。

在許多植物組織培養(yǎng)過程中，常遇到褐變問題。褐變主要發(fā)生在外植體，在植物愈傷組織的繼代、懸浮細胞培養(yǎng)以及原生質(zhì)體的分離與培養(yǎng)中也經(jīng)常發(fā)生。褐變產(chǎn)物不僅使外植體、細胞、培養(yǎng)基等變褐，而且對許多酶有抑制作用，從而影響培養(yǎng)材料的生長與分化，嚴重時甚至導(dǎo)致死亡。本文探討植物組織培養(yǎng)中褐變現(xiàn)象的影響因素、機理及防范措施，對我們進行科學(xué)研究或工廠生產(chǎn)，包括植物組織的培養(yǎng),原生質(zhì)體、懸浮細胞和植物器官的培養(yǎng)都有著十分重要的現(xiàn)實意義。

1褐變原因及危害

褐變是指外植體在培養(yǎng)過程中,自身組織從表面培養(yǎng)基釋放褐色物質(zhì),以致培養(yǎng)基逐漸變成褐色,外植體也隨之進一步變褐而死亡的現(xiàn)象。褐變的發(fā)生與外植體組織中所含的酚類化合物數(shù)量多少及多酚氧化酶活性有直接關(guān)系。很多植物，尤其是木本植物都含有較高的酚類化合物，這些酚類化合物在完整的組織和細胞中與多酚氧化酶分隔存在，因而比較穩(wěn)定。在切割外植體時，切口附近的細胞受到傷害，其分割狀態(tài)被打破，酚類化合物外溢。對于外植體本身來講，酚類物質(zhì)從外植體切口向外溢出是一種自我保護性反應(yīng)，可誘導(dǎo)植保素或無物理屏障的形成，以防止微生物侵染組織。但酚類很不穩(wěn)定，在溢出過程中與多酚氧化酶接觸，在多酚氧化酶的催化下，迅速氧化成褐色的醌類物質(zhì)和水，醌類物質(zhì)又會在酪氨酸酶等的作用下，與外植體組織中的蛋白質(zhì)發(fā)生聚合，進一步引起其他酶系統(tǒng)失活。從而導(dǎo)致組織代謝活動紊亂，生長停滯，最終衰老死亡。此外，由于組織的老化病變也會使多酚氧化酶激活而引起褐變。

2褐變產(chǎn)生的機理

2.1非酶促褐變

非酶促褐變是由于細胞受脅迫或其他不利條件影響所造成的細胞程序化死亡或自然發(fā)生的細胞死亡，即壞死形成的褐變現(xiàn)象，并不涉及酚類物質(zhì)的產(chǎn)生。徐振彪等[1]將生長正常的愈傷組織轉(zhuǎn)移到含NaCl的培養(yǎng)基中，組織周圍尤其是接觸培養(yǎng)基部分發(fā)生褐變，但培養(yǎng)基中沒有看到擴散的褐化物質(zhì)。當(dāng)溫度升高時繼代保存時間過長，也會發(fā)生此類現(xiàn)象。但這種褐變?nèi)舨扇∵m當(dāng)措施或者愈傷組織適應(yīng)了脅迫環(huán)境就不再發(fā)生了[3]。

2.2酶促褐變

目前認為植物組織培養(yǎng)中的褐變主要是由酶促褐變引起的，培養(yǎng)材料變褐主要是由傷口處分泌的酚類化合物引起的[4]。酶促褐變?nèi)缤话愕拿复俜磻?yīng)，其發(fā)生必須具備三個條件，即酶、底物和氧。引起褐變的酶有多酚氧化酶(PPO)、過氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶等。從初次培養(yǎng)和繼代培養(yǎng)過程中試管苗的褐變程度和PPO的活性來看，表明PPO活性的高低是引起培養(yǎng)材料褐變的關(guān)鍵。引起褐變的酶的底物主要是酚類化合物，按其組成可分成3類:苯基羧酸（包括鄰羥基苯酚、兒茶酚、沒食子酸、莽草酸等），苯丙烷衍生物（包括綠原酸、肉桂酸、香豆酸、咖啡酸、單寧、木質(zhì)素等），第三類是黃烷衍生物（包括花青素、黃酮、蕓香苷等），但并非所有的酚類物質(zhì)都是PPO的底物。

在正常發(fā)育的植物組織中,底物、氧氣、PPO同時存在并不發(fā)生褐變，是因為在正常的組織細胞內(nèi)由于多酚類物質(zhì)分布在細胞的液泡內(nèi)，而PPO則分布在各種質(zhì)體或細胞質(zhì)中，這種區(qū)域性分布使底物與PPO不能接觸。而當(dāng)細胞膜的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化和破壞時，則為酶創(chuàng)造了與PPO接觸的條件，在氧存在的情況下使酚類物質(zhì)氧化成醌，進行一系列的脫水、聚合反應(yīng)，形成黑褐色物質(zhì)，從而引起褐變。

3褐變產(chǎn)生的影響因素

影響植物組織培養(yǎng)褐變的因子是復(fù)雜的，因植物的種類、基因型、外植體部位及生理狀態(tài)等不同，褐變的程度也有所不同。

3.1植物種類及基因型不同的植物和不同的基因型決定了不同的褐化程度。在組織培養(yǎng)中，品種褐化難易可能是與該品種中多酚類物質(zhì)含量的多少及多酚氧化酶(PPO)活性的差異有關(guān)。

3.2外植體部位及生理狀態(tài)外植體的部位及生理狀態(tài)不同其褐化程度不同，同時，不同時期和不同年齡的外植體在培養(yǎng)中褐變的程度也不同。

3.3培養(yǎng)基成分培養(yǎng)基成分中的無機鹽、蔗糖濃度、激素水平等對褐變的程度的影響尤為重要。另外，其pH值也與褐變程度有較大關(guān)系。

3.4培養(yǎng)條件溫度過高或光照過強，均可加速被培養(yǎng)組織的褐變。不利環(huán)境條件都能造成細胞的程序化死亡，溫度是誘導(dǎo)程序化死亡的主要因素[1]。

4防止外植體產(chǎn)生褐變的對策

從理論上講,酶促褐變可以通過以下三種方法加以抑制:一是除去引起氧化的物質(zhì)——氧；二是捕捉或減少聚合反應(yīng)的中間產(chǎn)物；三是抑制有關(guān)的酶。實際操作上，下列措施是被認為行之有效的。

4.1適當(dāng)外植體的選擇

取材時應(yīng)注意選擇褐變程度較小的品種和部位作外植體。成年植株比幼苗褐變程度厲害，夏季材料比冬季及早春和秋季材料的褐變要嚴重。冬季的芽不易生長，宜選用早春和秋季的材料作為外植體。王異星[5]用荔枝無菌苗不同組織的誘導(dǎo)試驗表明，莖最容易誘導(dǎo)出愈傷組織，培養(yǎng)2周后長出淺黃色的愈傷組織；葉大部分不能產(chǎn)生愈傷組織或誘導(dǎo)出的愈傷組織中度褐變；而根極大部分不產(chǎn)生愈傷組織，誘導(dǎo)出的愈傷組織全部褐變。

4.2對外植體的處理

通過對較易褐變的外植體材料的預(yù)處理能減輕醌類物質(zhì)的毒害作用。處理方法如下：外植體經(jīng)流水沖洗后，在2-5℃的低溫下處理12-24小時，再用升汞或70%酒精消毒，然后接種于只含有蔗糖的瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)5-7天，使組織中的酚類物質(zhì)部分滲入培養(yǎng)基中。取出外植體用0.1%漂白粉溶液浸泡10分鐘，再接種到合適的培養(yǎng)基中。若仍有酚類物質(zhì)滲出，3-5天后再轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基2-3次，當(dāng)外植體的切口愈合后，酚類物質(zhì)減少，這樣可使外植體褐變減輕或被抑制。何瓊英等[6]用抗壞血酸預(yù)處理香蕉吸芽外植體，能減輕外植體褐變，從而提高芽叢誘導(dǎo)率。

4.3適宜的培養(yǎng)基

培養(yǎng)基的成分與褐變程度有關(guān)，要考慮所選培養(yǎng)基的狀態(tài)和類型。

4.3.1適當(dāng)?shù)臒o機鹽濃度張妙霞等[7]在柿樹組織培養(yǎng)防止褐變所進行的試驗中，4種培養(yǎng)基的無機鹽以改良MS(大量元素減半)和1/2MS的效果好，MS的效果較差，結(jié)果證明低濃度的無機鹽可促進外植體的生長與分化，減輕外植體褐變的程度。徐振彪[1]在對玉米幼胚耐NaCl愈傷組織的篩選表明，隨NaCl濃度升高，褐變現(xiàn)象加重。

4.3.2適當(dāng)和適量的激素王異星[5]在荔枝的組織培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基中添加1mg/LBA+0.5mg/L2,4-D時，愈傷組織較堅硬，增殖緩慢，易產(chǎn)生褐變。培養(yǎng)基中添加1mg/LBA+1mg/L2,4-D時，愈傷組織淺黃疏松，增殖也快。

4.3.3培養(yǎng)基的硬度在一定范圍內(nèi)，瓊脂用量大，培養(yǎng)基硬度大，褐變率低[8]，這可能是培養(yǎng)基的硬度影響了酚類物質(zhì)的擴散速度的緣故。

4.3.4培養(yǎng)基中水的硬度的影響硬度低的蒸餾水褐變率低,而使用硬度較高的自來水,褐變嚴重,甚至?xí)霈F(xiàn)褐變死亡[8]。這可能是配制培養(yǎng)基的水改變了培養(yǎng)基中無機鹽的濃度,間接地影響了植物外植體的褐變。

4.3.5培養(yǎng)基的pH值在水稻體細胞培養(yǎng)中，pH值為4.5-5.0時MS液體培養(yǎng)基可保持愈傷組織處于良好的生長狀態(tài)，其表面呈黃白色，而pH值為5.5-6.0時，愈傷組織嚴重褐變[9]。一般來說，酸性環(huán)境(pH值為4.5-5.0)不利于褐變過程的發(fā)生[10]。

4.3.6培養(yǎng)條件如溫度過高或光照過強，光照會提高PPO的活性，促進多酚類物質(zhì)的氧化，從而加速被培養(yǎng)的組織褐變。高濃度CO2也會促進褐變，其原因是環(huán)境中的CO2向細胞內(nèi)擴散，細胞內(nèi)CO32-增多，CO32-與細胞膜上的CO32-結(jié)合，使有效CO32-減少，導(dǎo)致內(nèi)膜系統(tǒng)瓦解，酚類物質(zhì)與PPO相互接觸，產(chǎn)生褐變[11]。因此，初期培養(yǎng)要在黑暗或弱光下進行。

4.4添加褐變抑制劑和吸附劑

褐變抑制劑主要包括抗氧化劑和PPO抑制劑。在培養(yǎng)基中加入偏二亞硫酸鈉、L-半胱氨酸、抗壞血酸、檸檬酸、二硫蘇糖醇等抗氧化劑都可以與氧化產(chǎn)物醌發(fā)生作用，使其重新還原為酚[12]。由于其作用過程均為消耗性的，在實際應(yīng)用中應(yīng)注意添加量，其中L-半胱氨酸和抗壞血酸均對外植體無毒副作用，在生產(chǎn)應(yīng)用中可不受限制。在水稻細胞的培養(yǎng)基中，添加植酸(PA)，可防止褐變，PA分子中眾多的羥基產(chǎn)生抗氧化作用，使生色物質(zhì)的含量下降或PA與PPO分子中的Cu2+結(jié)合，從而降低了其活力。陳學(xué)森等[13]在對植酸在銀杏組織培養(yǎng)中應(yīng)用的研究中也證實了植酸具有抑制多酚氧化酶活性的作用。

常用的吸附劑有活性炭和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。活性炭是一種吸附性較強的無機吸附劑，能吸附培養(yǎng)基中的有害物質(zhì)，包括瓊脂中的雜質(zhì)、培養(yǎng)物在培養(yǎng)過程中分泌的酚、醌類物質(zhì)以及蔗糖在高壓消毒時產(chǎn)生的5-羥甲基糠醛等,從而有利于培養(yǎng)物的生長。粉末狀的活性炭與顆粒狀的活性炭相比吸附性更強，一般在培養(yǎng)基中加入1-4g/L的活性炭。在使用過程中應(yīng)注意，盡量用低濃度的活性炭來對抗褐變的產(chǎn)生，因為活性炭的吸附作用是沒有選擇性的，在吸附物質(zhì)的同時，也會吸附培養(yǎng)基中的其他成分，對外植體的誘導(dǎo)分化會產(chǎn)生一定的負面影響[14]。而聚乙烯吡咯烷酮(PVP)是酚類物質(zhì)的專一性吸附劑，在生化制備中常用作酚類物質(zhì)和細胞器的保護劑，可用于防止褐變[15]。

4.5進行細胞篩選和多次轉(zhuǎn)移

在組織培養(yǎng)過程中，經(jīng)常進行細胞篩選，可以剔除易褐變的細胞。在外植體接種1-2天后應(yīng)立即轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基中，能減輕酚類物質(zhì)對培養(yǎng)物的毒害作用，降低抑制作用，使外植體盡快分生，連續(xù)轉(zhuǎn)移5-6次，可基本解決外植體的褐變問題。

植物組織培養(yǎng)論文:植物組織培養(yǎng)管理論文

論文關(guān)鍵詞:植物組織培養(yǎng)褐變酚類物質(zhì)多酚氧化酶醌類物質(zhì)

論文摘要:植物組織培養(yǎng)過程中，褐變問題普遍存在,與菌類污染和玻璃話現(xiàn)象并稱為植物組織培養(yǎng)的三大難題。針對褐變難題，本文結(jié)合相關(guān)資料，對影響褐變的因素作了分析，褐變的影響因素是復(fù)雜的，隨植物種類外植體的部位幾生理狀況培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的不同而危害的程度有所不同，對這些因素是內(nèi)因外界影響作用作了分析并針對這些因素提出了相應(yīng)的解決措施。

在許多植物組織培養(yǎng)過程中，常遇到褐變問題。褐變主要發(fā)生在外植體，在植物愈傷組織的繼代、懸浮細胞培養(yǎng)以及原生質(zhì)體的分離與培養(yǎng)中也經(jīng)常發(fā)生。褐變產(chǎn)物不僅使外植體、細胞、培養(yǎng)基等變褐，而且對許多酶有抑制作用，從而影響培養(yǎng)材料的生長與分化，嚴重時甚至導(dǎo)致死亡。本文探討植物組織培養(yǎng)中褐變現(xiàn)象的影響因素、機理及防范措施，對我們進行科學(xué)研究或工廠生產(chǎn)，包括植物組織的培養(yǎng),原生質(zhì)體、懸浮細胞和植物器官的培養(yǎng)都有著十分重要的現(xiàn)實意義。

1褐變原因及危害

褐變是指外植體在培養(yǎng)過程中,自身組織從表面培養(yǎng)基釋放褐色物質(zhì),以致培養(yǎng)基逐漸變成褐色,外植體也隨之進一步變褐而死亡的現(xiàn)象。褐變的發(fā)生與外植體組織中所含的酚類化合物數(shù)量多少及多酚氧化酶活性有直接關(guān)系。很多植物，尤其是木本植物都含有較高的酚類化合物，這些酚類化合物在完整的組織和細胞中與多酚氧化酶分隔存在，因而比較穩(wěn)定。在切割外植體時，切口附近的細胞受到傷害，其分割狀態(tài)被打破，酚類化合物外溢。對于外植體本身來講，酚類物質(zhì)從外植體切口向外溢出是一種自我保護性反應(yīng)，可誘導(dǎo)植保素或無物理屏障的形成，以防止微生物侵染組織。但酚類很不穩(wěn)定，在溢出過程中與多酚氧化酶接觸，在多酚氧化酶的催化下，迅速氧化成褐色的醌類物質(zhì)和水，醌類物質(zhì)又會在酪氨酸酶等的作用下，與外植體組織中的蛋白質(zhì)發(fā)生聚合，進一步引起其他酶系統(tǒng)失活。從而導(dǎo)致組織代謝活動紊亂，生長停滯，最終衰老死亡。此外，由于組織的老化病變也會使多酚氧化酶激活而引起褐變。

2褐變產(chǎn)生的機理

2.1非酶促褐變

非酶促褐變是由于細胞受脅迫或其他不利條件影響所造成的細胞程序化死亡或自然發(fā)生的細胞死亡，即壞死形成的褐變現(xiàn)象，并不涉及酚類物質(zhì)的產(chǎn)生。徐振彪等[1]將生長正常的愈傷組織轉(zhuǎn)移到含NaCl的培養(yǎng)基中，組織周圍尤其是接觸培養(yǎng)基部分發(fā)生褐變，但培養(yǎng)基中沒有看到擴散的褐化物質(zhì)。當(dāng)溫度升高時繼代保存時間過長，也會發(fā)生此類現(xiàn)象。但這種褐變?nèi)舨扇∵m當(dāng)措施或者愈傷組織適應(yīng)了脅迫環(huán)境就不再發(fā)生了[3]。

2.2酶促褐變

目前認為植物組織培養(yǎng)中的褐變主要是由酶促褐變引起的，培養(yǎng)材料變褐主要是由傷口處分泌的酚類化合物引起的[4]。酶促褐變?nèi)缤话愕拿复俜磻?yīng)，其發(fā)生必須具備三個條件，即酶、底物和氧。引起褐變的酶有多酚氧化酶(PPO)、過氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶等。從初次培養(yǎng)和繼代培養(yǎng)過程中試管苗的褐變程度和PPO的活性來看，表明PPO活性的高低是引起培養(yǎng)材料褐變的關(guān)鍵。引起褐變的酶的底物主要是酚類化合物，按其組成可分成3類:苯基羧酸（包括鄰羥基苯酚、兒茶酚、沒食子酸、莽草酸等），苯丙烷衍生物（包括綠原酸、肉桂酸、香豆酸、咖啡酸、單寧、木質(zhì)素等），第三類是黃烷衍生物（包括花青素、黃酮、蕓香苷等），但并非所有的酚類物質(zhì)都是PPO的底物。

在正常發(fā)育的植物組織中,底物、氧氣、PPO同時存在并不發(fā)生褐變，是因為在正常的組織細胞內(nèi)由于多酚類物質(zhì)分布在細胞的液泡內(nèi)，而PPO則分布在各種質(zhì)體或細胞質(zhì)中，這種區(qū)域性分布使底物與PPO不能接觸。而當(dāng)細胞膜的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化和破壞時，則為酶創(chuàng)造了與PPO接觸的條件，在氧存在的情況下使酚類物質(zhì)氧化成醌，進行一系列的脫水、聚合反應(yīng)，形成黑褐色物質(zhì)，從而引起褐變。

3褐變產(chǎn)生的影響因素

影響植物組織培養(yǎng)褐變的因子是復(fù)雜的，因植物的種類、基因型、外植體部位及生理狀態(tài)等不同，褐變的程度也有所不同。

3.1植物種類及基因型不同的植物和不同的基因型決定了不同的褐化程度。在組織培養(yǎng)中，品種褐化難易可能是與該品種中多酚類物質(zhì)含量的多少及多酚氧化酶(PPO)活性的差異有關(guān)。

3.2外植體部位及生理狀態(tài)外植體的部位及生理狀態(tài)不同其褐化程度不同，同時，不同時期和不同年齡的外植體在培養(yǎng)中褐變的程度也不同。

3.3培養(yǎng)基成分培養(yǎng)基成分中的無機鹽、蔗糖濃度、激素水平等對褐變的程度的影響尤為重要。另外，其pH值也與褐變程度有較大關(guān)系。

3.4培養(yǎng)條件溫度過高或光照過強，均可加速被培養(yǎng)組織的褐變。不利環(huán)境條件都能造成細胞的程序化死亡，溫度是誘導(dǎo)程序化死亡的主要因素[1]。

4防止外植體產(chǎn)生褐變的對策

從理論上講,酶促褐變可以通過以下三種方法加以抑制:一是除去引起氧化的物質(zhì)——氧；二是捕捉或減少聚合反應(yīng)的中間產(chǎn)物；三是抑制有關(guān)的酶。實際操作上，下列措施是被認為行之有效的。

4.1適當(dāng)外植體的選擇

取材時應(yīng)注意選擇褐變程度較小的品種和部位作外植體。成年植株比幼苗褐變程度厲害，夏季材料比冬季及早春和秋季材料的褐變要嚴重。冬季的芽不易生長，宜選用早春和秋季的材料作為外植體。王異星[5]用荔枝無菌苗不同組織的誘導(dǎo)試驗表明，莖最容易誘導(dǎo)出愈傷組織，培養(yǎng)2周后長出淺黃色的愈傷組織；葉大部分不能產(chǎn)生愈傷組織或誘導(dǎo)出的愈傷組織中度褐變；而根極大部分不產(chǎn)生愈傷組織，誘導(dǎo)出的愈傷組織全部褐變。

4.2對外植體的處理

通過對較易褐變的外植體材料的預(yù)處理能減輕醌類物質(zhì)的毒害作用。處理方法如下：外植體經(jīng)流水沖洗后，在2-5℃的低溫下處理12-24小時，再用升汞或70%酒精消毒，然后接種于只含有蔗糖的瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)5-7天，使組織中的酚類物質(zhì)部分滲入培養(yǎng)基中。取出外植體用0.1%漂白粉溶液浸泡10分鐘，再接種到合適的培養(yǎng)基中。若仍有酚類物質(zhì)滲出，3-5天后再轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基2-3次，當(dāng)外植體的切口愈合后，酚類物質(zhì)減少，這樣可使外植體褐變減輕或被抑制。何瓊英等[6]用抗壞血酸預(yù)處理香蕉吸芽外植體，能減輕外植體褐變，從而提高芽叢誘導(dǎo)率。

4.3適宜的培養(yǎng)基

培養(yǎng)基的成分與褐變程度有關(guān)，要考慮所選培養(yǎng)基的狀態(tài)和類型。

4.3.1適當(dāng)?shù)臒o機鹽濃度張妙霞等[7]在柿樹組織培養(yǎng)防止褐變所進行的試驗中，4種培養(yǎng)基的無機鹽以改良MS(大量元素減半)和1/2MS的效果好，MS的效果較差，結(jié)果證明低濃度的無機鹽可促進外植體的生長與分化，減輕外植體褐變的程度。徐振彪[1]在對玉米幼胚耐NaCl愈傷組織的篩選表明，隨NaCl濃度升高，褐變現(xiàn)象加重。

4.3.2適當(dāng)和適量的激素王異星[5]在荔枝的組織培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基中添加1mg/LBA+0.5mg/L2,4-D時，愈傷組織較堅硬，增殖緩慢，易產(chǎn)生褐變。培養(yǎng)基中添加1mg/LBA+1mg/L2,4-D時，愈傷組織淺黃疏松，增殖也快。

4.3.3培養(yǎng)基的硬度在一定范圍內(nèi)，瓊脂用量大，培養(yǎng)基硬度大，褐變率低[8]，這可能是培養(yǎng)基的硬度影響了酚類物質(zhì)的擴散速度的緣故。

4.3.4培養(yǎng)基中水的硬度的影響硬度低的蒸餾水褐變率低,而使用硬度較高的自來水,褐變嚴重,甚至?xí)霈F(xiàn)褐變死亡[8]。這可能是配制培養(yǎng)基的水改變了培養(yǎng)基中無機鹽的濃度,間接地影響了植物外植體的褐變。

4.3.5培養(yǎng)基的pH值在水稻體細胞培養(yǎng)中，pH值為4.5-5.0時MS液體培養(yǎng)基可保持愈傷組織處于良好的生長狀態(tài)，其表面呈黃白色，而pH值為5.5-6.0時，愈傷組織嚴重褐變[9]。一般來說，酸性環(huán)境(pH值為4.5-5.0)不利于褐變過程的發(fā)生[10]。

4.3.6培養(yǎng)條件如溫度過高或光照過強，光照會提高PPO的活性，促進多酚類物質(zhì)的氧化，從而加速被培養(yǎng)的組織褐變。高濃度CO2也會促進褐變，其原因是環(huán)境中的CO2向細胞內(nèi)擴散，細胞內(nèi)CO32-增多，CO32-與細胞膜上的CO32-結(jié)合，使有效CO32-減少，導(dǎo)致內(nèi)膜系統(tǒng)瓦解，酚類物質(zhì)與PPO相互接觸，產(chǎn)生褐變[11]。因此，初期培養(yǎng)要在黑暗或弱光下進行。

4.4添加褐變抑制劑和吸附劑

褐變抑制劑主要包括抗氧化劑和PPO抑制劑。在培養(yǎng)基中加入偏二亞硫酸鈉、L-半胱氨酸、抗壞血酸、檸檬酸、二硫蘇糖醇等抗氧化劑都可以與氧化產(chǎn)物醌發(fā)生作用，使其重新還原為酚[12]。由于其作用過程均為消耗性的，在實際應(yīng)用中應(yīng)注意添加量，其中L-半胱氨酸和抗壞血酸均對外植體無毒副作用，在生產(chǎn)應(yīng)用中可不受限制。在水稻細胞的培養(yǎng)基中，添加植酸(PA)，可防止褐變，PA分子中眾多的羥基產(chǎn)生抗氧化作用，使生色物質(zhì)的含量下降或PA與PPO分子中的Cu2+結(jié)合，從而降低了其活力。陳學(xué)森等[13]在對植酸在銀杏組織培養(yǎng)中應(yīng)用的研究中也證實了植酸具有抑制多酚氧化酶活性的作用。

常用的吸附劑有活性炭和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。活性炭是一種吸附性較強的無機吸附劑，能吸附培養(yǎng)基中的有害物質(zhì)，包括瓊脂中的雜質(zhì)、培養(yǎng)物在培養(yǎng)過程中分泌的酚、醌類物質(zhì)以及蔗糖在高壓消毒時產(chǎn)生的5-羥甲基糠醛等,從而有利于培養(yǎng)物的生長。粉末狀的活性炭與顆粒狀的活性炭相比吸附性更強，一般在培養(yǎng)基中加入1-4g/L的活性炭。在使用過程中應(yīng)注意，盡量用低濃度的活性炭來對抗褐變的產(chǎn)生，因為活性炭的吸附作用是沒有選擇性的，在吸附物質(zhì)的同時，也會吸附培養(yǎng)基中的其他成分，對外植體的誘導(dǎo)分化會產(chǎn)生一定的負面影響[14]。而聚乙烯吡咯烷酮(PVP)是酚類物質(zhì)的專一性吸附劑，在生化制備中常用作酚類物質(zhì)和細胞器的保護劑，可用于防止褐變[15]。

4.5進行細胞篩選和多次轉(zhuǎn)移

在組織培養(yǎng)過程中，經(jīng)常進行細胞篩選，可以剔除易褐變的細胞。在外植體接種1-2天后應(yīng)立即轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基中，能減輕酚類物質(zhì)對培養(yǎng)物的毒害作用，降低抑制作用，使外植體盡快分生，連續(xù)轉(zhuǎn)移5-6次，可基本解決外植體的褐變問題。

植物組織培養(yǎng)論文:瀕危植物南川木菠蘿組織培養(yǎng)技術(shù)研究

摘要 南川木菠蘿是我國最為珍稀的特有極危物種之一，開展其組織培養(yǎng)研究具有十分重要的意義。從外植體選擇到幼苗移栽，對南川木菠蘿組織培養(yǎng)各相關(guān)環(huán)節(jié)進行了研究。首次建立起了南川木菠蘿的組織培養(yǎng)體系。結(jié)果表明：南川木菠蘿組織培養(yǎng)適宜的外植體為帶芽莖段，并探明了獲得無菌外植體的方法；南川木菠蘿愈傷培養(yǎng)的挑選培養(yǎng)基為WPM+2.0 mg/L 2，4-D+0.2（或0.3） mg/L 6-BA+3 g/L PVP，芽誘導(dǎo)挑選培養(yǎng)基為WPM+3.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+3 g/L PVP，生根挑選培養(yǎng)基為WPM+1.5 mg/L IBA+0.1 mg/L NAA+3 g/L PVP；適宜的組培苗煉苗時長為6～9 d，使用滅菌營養(yǎng)土較好，移栽存活率可達90%以上。

關(guān)鍵詞 瀕危植物；南川木菠蘿；組織培養(yǎng)

南川木菠蘿（Artocarpusnanchuanensis S.S.Chang），別名南川面包樹、水冬瓜、瓜瓢、大楊梅，是多年生高大喬木植物，系桑科波羅蜜屬中分布在我國最北端的植物種。1989 年由中國科學(xué)院昆明植物研究所吳征鎰院士和張秀實教授在《云南植物研究》11 卷第1 期上正式發(fā)表定為桑科的一個新種[1]。2004年，南川木菠蘿被《中國物種紅色名錄》確定為“極危”物種，是我國最為珍稀的特有植物之一[2]。目前報道，主要分布于重慶部分區(qū)、縣[3]，已發(fā)現(xiàn)并得到良好保護的野生南川木菠蘿有6 個居群，結(jié)果母樹100株左右[4]。

目前，野生資源調(diào)查顯示南川木菠蘿喜光，耐貧瘠；散生于海拔900 m以下的山地、丘陵[3]；樹干直立、粗壯，樹高可達25 m以上，樹干胸徑可達60 cm以上，低分枝，樹葉繁茂；葉革質(zhì)，長圓形、橢圓形或近圓形，表面光滑，葉綠色或濃綠色（圖 1）。因此，南川木菠蘿表現(xiàn)出樹形美觀，抗逆性強，病蟲害極少，具有較好的園林景觀和生態(tài)效應(yīng)，是難得的行道樹、庭園綠化的品質(zhì)樹種。2008 年重慶市將其確定為主城新城區(qū)9 個基調(diào)樹種之一[2-3]。另外，南川木菠蘿果實形似面包（圖 1），具有較高的營養(yǎng)和醫(yī)用保健價值，含有人體必需的多種糖、蛋白質(zhì)、氨基酸和酯類以及一些人體所必需的微量元素和多種維生素，可加工調(diào)制出風(fēng)味獨特、品質(zhì)優(yōu)良的果酒、果汁、果脯及果醬等；通便通氣的效果明顯，對便秘等腸道疾病具有較好的控制作用，民間使用表明，其樹皮和樹根對人體的皮膚病有較好的療效。其木材紅棕色，紋理細密、質(zhì)地堅硬，可用來制作家具。因此，南川木菠蘿可以從園林、飲料食品、醫(yī)藥保健、經(jīng)濟木材等方面進行開發(fā)利用[3]。南川木菠蘿的價值逐漸引起了相關(guān)單位的關(guān)注并初步展開了引種工作。例如，貴州亞熱帶作物生物質(zhì)能源研究所周正邦等[5]研究表明，南川木菠蘿可以成功引種到貴州望謨和興義等地，這對貴州熱區(qū)生態(tài)建設(shè)、特色農(nóng)業(yè)開發(fā)等具有重要意義。為增加貴州特色優(yōu)新物種，同時引種的太平洋面包樹則不能安全越冬。

但是，南川木菠蘿種子具有休眠特性，少數(shù)休眠期可長達1年，發(fā)芽出苗不一致。因此，南川木菠蘿的自然更新和繁衍能力極差。人工繁殖多為播種繁殖，秋播采用隨采隨播，春播需要進行沙藏處理。可扦插繁殖，但成活率低[3]。相關(guān)單位對這一珍稀物種資源進行了多年的調(diào)查研究，南川木菠蘿的種子繁殖技術(shù)取得了某些階段性成果[2]，形成了扦插繁殖方法，但扦插成活率僅50%左右[6]，其繁殖受到季節(jié)影響，且需要大量土地和人工，不利于規(guī)模化生產(chǎn)。因此，建立南川木菠蘿的組織培養(yǎng)技術(shù)可很好地保護南川木菠蘿這一瀕危植物資源，解決產(chǎn)業(yè)開發(fā)所需種苗。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗材料采集于重慶市綦江區(qū)東坡鎮(zhèn)南川木菠蘿野生群，選用10年以上南川木菠蘿植株的幼葉和幼嫩枝條進行組織培養(yǎng)體系的建立。將幼嫩枝條剪切成帶有1～2個芽、長3～6 cm的帶芽莖段和長2 cm左右的無芽幼嫩莖段。以南川木菠蘿幼葉以及制作好的帶芽莖段和無芽幼嫩莖段作為組織培養(yǎng)的外植體。

1.2 材料處理

1.2.1 無菌外植體的制作。將幼葉、帶芽莖段和無芽幼嫩莖段先用流水沖洗20 min，蒸餾水沖洗3～5次，然后在超凈工作臺用75%乙醇處理30～60 s，無菌水沖洗3次，再用 2%次氯酸鈉（滴加幾滴tween-20）處理10～15 min，無菌濾紙吸干水，接種至相應(yīng)培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)。

1.2.2 組織培養(yǎng)方法。消毒完成的帶芽莖段首先放入枝條生長培養(yǎng)基，再選取重新生長出來的幼葉切割成1～2 cm2的外植體進行愈傷誘導(dǎo)。直接從成年大樹上采集的幼葉和幼嫩莖段經(jīng)過消毒處理后，幼葉切割為1～2 cm2，幼嫩莖段切割為1.5～2.0 cm直接進行愈傷誘導(dǎo)。外植體誘導(dǎo)形成的愈傷，再經(jīng)過芽的分化誘導(dǎo)、生根培養(yǎng)及移栽成苗。

1.3 培養(yǎng)基配制

采用高壓蒸汽進行培養(yǎng)基滅菌，設(shè)定在121 ℃、0.105 MPa 的壓力下，滅菌15～20 min，滅好備用。

1.3.1 枝條生長培養(yǎng)基。以WPM（Woody Plant Medium）為基本培養(yǎng)基，附加3 g/L聚乙烯吡咯烷酮（PVP，Polyvinylpyrr-olidone）。

1.3.2 愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基。以WPM為基本培養(yǎng)基，pH值為5.7，附加6-BA和2，4-D或IAA，具體濃度設(shè)計組成如表1所示。PVP附加濃度為3.0 g/L。每個處理設(shè)計30個外植體，統(tǒng)計愈傷誘導(dǎo)率（愈傷誘導(dǎo)率=形成愈傷外植體數(shù)/總外植體數(shù)）。

1.3.3 芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基。以WPM為基本培養(yǎng)基，pH值為5.8，附加不同濃度6-BA、NAA和3 g/L的PVP，6-BA設(shè)計5個濃度分別為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/L，NAA設(shè)計2個濃度分別為0.1、0.2 mg/L，不同濃度的6-BA和NAA進行兩兩組合配制培養(yǎng)基。每種激素組合接種愈傷3瓶，每瓶接種帶有愈傷的外植體5塊，并統(tǒng)計芽誘導(dǎo)率。

1.3.4 生根培養(yǎng)基。以WPM為基本培養(yǎng)基，pH值為5.8，附加不同濃度IBA、NAA和3 g/L的PVP，IBA設(shè)計4個濃度為0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L，NAA設(shè)計2個濃度為0.1、0.2 mg/L。每個濃度處理使用20個幼苗，統(tǒng)計出根苗數(shù)，計算生根率[生根率（%）=生根苗數(shù)/總苗數(shù)×100]，3個月后結(jié)束生根統(tǒng)計。

1.4 培養(yǎng)條件

愈傷誘導(dǎo)階段采用暗處理，28 ℃，48 h，其他無菌培養(yǎng)條件為白天溫度25 ℃，夜晚18 ℃；光照強度1 000～2 000 lx；光暗周期15 h/9 h；相對濕度80%。瓊脂用量為6.0 g/L，培養(yǎng)基pH值5.8。

1.5 煉苗移栽

將盛放有生根的無菌南川木菠蘿幼苗的培養(yǎng)瓶去掉封口膜進行煉苗，煉苗后再移栽于營養(yǎng)土中生長。營養(yǎng)土使用patel peat（England newton international Group CO.，Ltd.），營養(yǎng)土處理設(shè)計滅菌（121 ℃、0.105 MPa，滅菌15 min）和不滅菌。煉苗時間長設(shè)計5個處理，分別為0、3、6、9、12、15 d，每個處理10株。統(tǒng)計移栽存活率[移栽存活率（%）=存活苗數(shù)/移栽總苗數(shù)×100]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同激素組合對南川木菠蘿愈傷誘導(dǎo)的影響

取無菌帶芽莖段新長出的嫩葉，并切割成約1.0 cm×1.5 cm大小的外植體，置于附加不同激素的愈傷培養(yǎng)基進行愈傷誘導(dǎo)。接種10～12 d后，葉片周圍明顯增厚，體積膨大，周圍先形成愈傷組織。30 d后進行愈傷誘導(dǎo)統(tǒng)計，結(jié)果表明不同激素和濃度其愈傷組織誘導(dǎo)率差異明顯，附加 2，4-D的培養(yǎng)基愈傷誘導(dǎo)率為17%～，而附加IAA的愈傷誘導(dǎo)率為7%～50%。附加2，4-D對南川木菠蘿葉片愈傷的誘導(dǎo)以2.0 mg/L水平好，平均誘導(dǎo)率約為98%，比1.0 mg/L和3.0 mg/L 2，4-D的平均誘導(dǎo)率分別高70、11個百分點。在研究中2，4-D對南川木菠蘿葉子的愈傷誘導(dǎo)效果比IAA好，其中WPM+2.0 mg/L 2，4-D+0.2（或0.3）mg/L 6-BA以及WPM+3.0 mg/L 2，4-D+0.2 mg/L 6-BA誘導(dǎo)率高達（表1）。

2.2 不同外植體南川木菠蘿的愈傷誘導(dǎo)

從母株上采取的嫩葉、無芽幼莖在各愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)7～10 d后表現(xiàn)出褐化現(xiàn)象（圖2A、B）；而帶芽莖段在枝條培養(yǎng)基培養(yǎng)20～25 d可長出新葉，再利用長出的新葉作為外植體可在愈傷培養(yǎng)基上形成良好愈傷（圖2C）。因此，本研究在進一步探索南川木菠蘿的組織培養(yǎng)體系時，以帶芽莖段長出的新葉為材料進行愈傷誘導(dǎo)、幼芽誘導(dǎo)及生根培養(yǎng)的研究。

2.3 不同激素組合對南川木菠蘿芽誘導(dǎo)的影響

在愈傷培養(yǎng)基中培養(yǎng)3～4周后轉(zhuǎn)入芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基，不同激素組合的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基對愈傷組織培養(yǎng)的褐化程度不同，其中附加1.0 mg/L和5.0 mg/L的6-BA愈傷褐化程度較高，本研究使用的30個愈傷外植體沒有誘導(dǎo)出芽（圖2D），附加2.0 mg/L和3.0 mg/L的6-BA的培養(yǎng)基芽誘導(dǎo)效果較好（圖2F），其中培養(yǎng)基WPM+3.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+3 g/L PVP芽誘導(dǎo)率較高，30個外植體可誘導(dǎo)60個芽。當(dāng)提高6-BA附加濃度到4.0 mg/L，芽誘導(dǎo)率極低，30個外植體誘導(dǎo)出2個芽，且褐化較重（圖2E）。NAA的濃度以0.2 mg/L與6-BA 的組合，較適宜南川木菠蘿芽的誘導(dǎo)。

2.4 生根培養(yǎng)

當(dāng)芽伸長到3～5 cm時，從基部切取幼苗，并帶少量愈傷接入生根培養(yǎng)基。不同激素對南川木菠蘿芽的根誘導(dǎo)，以培養(yǎng)基WPS+1.5 mg/L IBA+0.1 mg/L NAA+3 mg/L PVP效果好，生根率達75%，相對較高，1個月左右可使幼苗生根（圖2G、H），而附加1.0 mg/L的IBA培養(yǎng)基生根需要約2個月，且生根率為25%，相對較低。當(dāng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基中附加0.5、2.0 mg/L的IBA時，3個月內(nèi)不能誘導(dǎo)出根。

2.5 幼苗馴化移栽

幼苗在生根培養(yǎng)基生長到6～8 cm時開始煉苗移栽，移栽前揭開封口膜進行煉苗。之后去掉大部分葉片和殘留培養(yǎng)基，保留2～3片葉移入滅菌營養(yǎng)土。本研究結(jié)果表明，滅菌營養(yǎng)土可以提高移栽存活率，在煉苗6 d的情況下，移栽15株幼苗存活14株，而使用未滅菌營養(yǎng)土移栽15株幼苗存活7株，可能由于滅菌營養(yǎng)土菌體相對較少，能更好使無菌苗適應(yīng)由無菌環(huán)境轉(zhuǎn)入有菌環(huán)境。煉苗時間6～9 d比較適宜，在滅菌營養(yǎng)土中存活率可達90%，而0、3、12、15 d煉苗時長相應(yīng)的存活率分別為10%、30%、50%、30%。當(dāng)煉苗時間較短時進行移栽，幼嫩莖段易干枯，影響存活率，煉苗時間較長則容易長菌，而且失水嚴重，降低移栽存活率。苗期要注意保持水分，使?fàn)I養(yǎng)土保持潤濕，移栽后約7 d即可恢復(fù)生長（圖2I）。

3 結(jié)論與討論

本研究建立的南川木菠蘿組織培養(yǎng)繁殖體系，幼葉愈傷率達，芽誘導(dǎo)率200%（30個愈傷外植體可誘導(dǎo)出60個芽），生根率達75%以上，移栽成活率90%以上。因此，可以利用該技術(shù)開展南川木菠蘿的規(guī)模化生產(chǎn)。本研究中無菌南川木菠蘿組培苗進行移栽時，使用滅菌營養(yǎng)土可以提高移栽成活率，可能由于滅菌營養(yǎng)土菌體相對較少，能更好使無菌苗適應(yīng)由無菌環(huán)境轉(zhuǎn)入有菌環(huán)境。

南川木菠蘿是一種高大喬木植物，在進行組織培養(yǎng)時褐化現(xiàn)象比較嚴重。本研究表明，PVP、適當(dāng)?shù)募に貪舛群团浔瓤梢砸欢ǔ潭葴p緩褐化現(xiàn)象，探索抑制組織培養(yǎng)中的褐化現(xiàn)象，將是改良南川木菠蘿組織培養(yǎng)技術(shù)的途徑之一。例如，本研究對愈傷進行芽誘導(dǎo)時，如果在芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中附加1.0 mg/L的6-BA，愈傷呈現(xiàn)發(fā)育緩慢，培養(yǎng)3 d左右即出現(xiàn)較嚴重的褐化現(xiàn)象，不能分化出芽；當(dāng)6-BA濃度增加到3.0 mg/L時，褐化相對較輕，能分化出芽，可能與提高6-BA的濃度進而促進細胞分裂有關(guān)；當(dāng)6-BA濃度增加到5.0 mg/L時，褐化相對1.0 mg/L的濃度輕，但較3.0 mg/L濃度嚴重，且發(fā)育緩慢，檢測的30個外植體中沒有芽的分化，可能是高濃度的6-BA破壞了組織發(fā)育的激素平衡。可溶性聚乙烯吡咯烷酮（PVP）是酚類物質(zhì)的專一性吸附劑，用于防止褐化的發(fā)生，PVP能減輕南川木菠蘿組織培養(yǎng)中的褐化率，2～5 g/L的濃度都有作用，以3 g/L效果較好。一些研究表明，除了聚乙烯吡咯烷酮（PVP），硫代硫酸鈉（Na2S2O3）、活性炭、Vc、檸檬酸等抗褐劑能減輕愈傷的褐化率[7-9]，褐化程度還與培養(yǎng)基中激素種類和濃度密切相關(guān)，合理使用激素能有效促進細胞生長，緩解褐化[10-12]。

植物組織培養(yǎng)論文:農(nóng)村青年植物組織培養(yǎng)技術(shù)職業(yè)培訓(xùn)存在的問題及改進措施

摘要 本文對農(nóng)村青年中開展的植物組織培養(yǎng)技術(shù)培訓(xùn)進行探討，分析了培訓(xùn)過程中存在的問題，總結(jié)相應(yīng)的改進措施和取得的成效，以期為后期該項技術(shù)的進一步培訓(xùn)推廣提供參考。

關(guān)鍵詞 農(nóng)村青年；植物組織培養(yǎng)；職業(yè)培訓(xùn)；問題；措施；成效

植物組織培養(yǎng)技術(shù)是繁育苗木花卉種苗的一種新方法。它是在無菌的環(huán)境條件下，將離體的植物材料接種到人工合成的培養(yǎng)基上，并控制相應(yīng)的溫度、光照、濕度等環(huán)境l件，使植物材料正常生長、分化并再生成完整植株的過程。植物組織培養(yǎng)技術(shù)對于植物優(yōu)良品種的繁育、無病毒苗木生產(chǎn)、新品種選育、種質(zhì)資源保存等方面有著較大的優(yōu)勢，同時也產(chǎn)生了巨大的經(jīng)濟效益和社會效益。目前，農(nóng)村對于這項技術(shù)也在逐步推廣。現(xiàn)就農(nóng)村青年中對于植物組織培養(yǎng)技術(shù)職業(yè)培訓(xùn)過程中存在的問題、解決措施及取得的成效進行探討，為后期的繼續(xù)培訓(xùn)提供參考意見。

1 存在的問題

1.1 培訓(xùn)教材選用不適

本期教材按照培訓(xùn)大綱編寫，語言過分生硬，內(nèi)容大多采用專業(yè)術(shù)語，使得本身文化水平偏低的農(nóng)村青年在沒有接受專業(yè)教育的前提下難以接受授課教師在培訓(xùn)時所述內(nèi)容，并且不能夠理解教材上的專有名詞。培訓(xùn)后學(xué)員也沒有花時間復(fù)習(xí)，導(dǎo)致學(xué)員所學(xué)知識都是一知半解，對于后面知識的進一步學(xué)習(xí)造成很大的障礙，導(dǎo)致即使是經(jīng)過了系統(tǒng)培訓(xùn)的學(xué)員也不能夠正確理解授課教師所述的內(nèi)容，造成了學(xué)員在經(jīng)過系統(tǒng)培訓(xùn)后，并不能夠真正掌握這項技術(shù)[1-2]。

1.2 學(xué)員組織紀律渙散

本期所培訓(xùn)的學(xué)員年齡大多在28周歲以上，由于與接受學(xué)校正規(guī)教育已有很長時間，所以突然集中學(xué)習(xí)則打不起精神。考慮到學(xué)員白天在家要干農(nóng)活，所以前期理論知識培訓(xùn)都安排在19：00開始，雖然培訓(xùn)時間安排在夜間，但是大多數(shù)學(xué)員仍有各種原因不能按時到場，即使到場的學(xué)員也不能夠認真聽取培訓(xùn)教師的講解，導(dǎo)致培訓(xùn)進度滯后[3-4]。

1.3 實踐操作動手能力差

由于植物組織培養(yǎng)對于實踐操作要求較高，所以在實踐操作中，采用先演示再逐個操作的流程進行。發(fā)現(xiàn)在操作過程中大部分學(xué)員并不能靈活使用各種接種器械和相關(guān)儀器，動作比較生硬、丟三落四，整個無菌操作不太標準和規(guī)范，導(dǎo)致組培試驗出現(xiàn)誤差，甚至整個試驗的失敗。同時，大部分學(xué)員理論和實踐過程中雖然遇到各種問題，由于思維方式的固定，并不能理解并接納教師的意見和建議，依然按照自己的想法進行，導(dǎo)致培訓(xùn)結(jié)果不太理想。

1.4 思維方式局限

農(nóng)村青年由于教育水平有限，認識面較窄，即使培訓(xùn)教師在對基本問題進行講解時，他們也不能夠很好地去理解問題，客觀地面對問題，尋找解決問題的方法，在原本簡單的問題上卻要使用一成不變的方法，不能夠很好地運用科學(xué)思維方式來解決問題。這是他們一直以來所受到的教育方式及水平導(dǎo)致的，他們的思維方式受到一定的局限。

1.5 觀念滯后

農(nóng)村青年因生活在科技文化普及滯后的農(nóng)村，接觸植物組織培養(yǎng)技術(shù)之初并不能在觀念上引起他們的重視，面對新事物，他們并不確信這項新的技術(shù)能給他們帶來可觀的經(jīng)濟收益，故而對培訓(xùn)也只是抱著試試看的心態(tài)，這也就導(dǎo)致了培訓(xùn)時不能很投入地認真學(xué)習(xí)。

2 改進措施及成效

針對上述存在的問題，采取了一系列措施，取得了良好的效果。

2.1 調(diào)整教材，改變教學(xué)方法

使用通俗易懂的語言改編教材，并且通過不斷的培訓(xùn)，發(fā)現(xiàn)問題，及時找到教材的缺點并改正，盡量使得教材內(nèi)容完整，使得農(nóng)村青年在自己單獨閱讀的時候也能夠理解教材內(nèi)容。同時，在培訓(xùn)過程中，授課教師使用講解與視頻相結(jié)合的方法，圖文并茂，簡潔明了，既提高了學(xué)員的興趣，也使其逐步變被動學(xué)習(xí)為主動學(xué)習(xí)。

2.2 實踐與理論結(jié)合，增強動手能力

為了讓學(xué)員盡快在培訓(xùn)過程中有效地將理論與實踐充分結(jié)合，掌握無菌操作的要點，特地選擇了不同植物的葉片、莖段、莖尖為外植體，從材料如何消毒到如何接種到培養(yǎng)瓶的相關(guān)步驟都是通過一個人現(xiàn)場操作，另一個在旁邊解說的形式完成。學(xué)員一邊拍照，一邊做記錄。講解完成后，學(xué)員親自開始操作，然后教師再針對操作中的問題，現(xiàn)場解答。通過3～4次課的學(xué)習(xí)后，發(fā)現(xiàn)學(xué)員已對整個無菌操作要點有所掌握，對于后期知識的進一步學(xué)習(xí)也變得容易多了。

2.3 大力宣傳現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術(shù)，增強學(xué)習(xí)主動性

通過職能部門大力宣傳國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)，降低現(xiàn)代農(nóng)業(yè)成本，提高經(jīng)濟效益，讓當(dāng)代農(nóng)村青年正確理解現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)的重要性，發(fā)揮農(nóng)村青年能吃苦的精神，為國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展做出貢獻，使得農(nóng)村青年正確認識現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)，提高他們對現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術(shù)的興趣，增強他們學(xué)習(xí)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術(shù)的主動性。

3 結(jié)語

通過對農(nóng)村青年現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技知識的培訓(xùn)，能夠激發(fā)當(dāng)代農(nóng)村青年的學(xué)習(xí)積極性，從而讓他們重新拿起課本，接受現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的再教育，并進一步提高農(nóng)村青年的創(chuàng)新精神，提升他們的實踐動手能力及創(chuàng)新意識，使其有效地認識到現(xiàn)代科技農(nóng)業(yè)的發(fā)展，為利用新的方法繁育種苗和花卉打下堅實的基礎(chǔ)。

植物組織培養(yǎng)論文:植物組織培養(yǎng)技術(shù)在中藥資源中的應(yīng)用

[摘要] 植物組織培養(yǎng)技術(shù)以其獨特的優(yōu)勢被廣泛的應(yīng)用于中藥資源領(lǐng)域，在中藥資源保護方面發(fā)揮了重要的作用。該文綜述了近年來植物組織培養(yǎng)的一些應(yīng)用，包括植物組織培養(yǎng)生產(chǎn)藥用植物活性化合物、遺傳多樣性分析、道地藥材、誘導(dǎo)子應(yīng)用、生物合成及轉(zhuǎn)基因植物等。通過以上研究將進一步促進植物組織培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，使其在中藥資源領(lǐng)域發(fā)揮更大的作用。

[關(guān)鍵詞] 植物組織培養(yǎng)； 中藥資源； 誘導(dǎo)子； 生物合成

中藥資源是我國中藥產(chǎn)業(yè)的基石，隨著我國中藥工藝的快速發(fā)展，大型和超大型企業(yè)不斷涌現(xiàn)、形成和發(fā)展，對我國的中藥資源形成了很大的壓力，近些年中藥材瀕危資源的不斷增加，中藥材價格的不斷增長，足以表明我國資源保護和可持續(xù)利用工作的緊迫性和重要性。通過發(fā)展植物組織培養(yǎng)技術(shù)來解決中藥材的資源問題，對我國具有特殊而且重要的意義。植物組織培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用可以體現(xiàn)在以下幾個方面：①通過植物組織和器官培養(yǎng)生產(chǎn)活性成分，保護瀕危和珍稀藥用植物資源；②通過遺傳多樣性分析，對植物組織培養(yǎng)材料進行評價；③通過植物組織培養(yǎng)技術(shù)研究道地藥材遺傳機制和環(huán)境機制；④通過誘導(dǎo)子的添加提高培養(yǎng)物中活性成分含量；⑤利用植物組織培養(yǎng)物進行基因功能篩選、驗證及遺傳轉(zhuǎn)化研究。本文將從以上幾個方面綜述近年來植物組織培養(yǎng)技術(shù)在中藥資源領(lǐng)域中的應(yīng)用。

1 植物組織培養(yǎng)生產(chǎn)藥用植物活性化合物

藥用植物細胞，毛狀根和不定根培養(yǎng)技術(shù)是生產(chǎn)藥用植物次級代謝產(chǎn)物的一種非常有價值的工具。因此，通過細胞培養(yǎng)生產(chǎn)次級代謝產(chǎn)物的植物將近1 000種，超過600種的活性成分直接由植物細胞培養(yǎng)提供。目前，100多種毛狀根已經(jīng)成功的被發(fā)根土壤農(nóng)桿菌誘導(dǎo)[1]，主要通過優(yōu)化培養(yǎng)基和關(guān)鍵生理因素去增加毛狀根培養(yǎng)的次級代謝產(chǎn)物的生成。目前，人參，三七，柴胡，甘草，丹參，雷公藤和許多種藥用植物已經(jīng)制定了不定根培養(yǎng)體系。目前，為了大量的生產(chǎn)次級代謝產(chǎn)物，細胞、不定根、毛狀根已經(jīng)成功地應(yīng)用于大規(guī)模培養(yǎng)。例如，人參不定根培養(yǎng)已經(jīng)達到3萬L。金絲桃不定根已經(jīng)達到500 L，紫錐菊不定根已經(jīng)達到1 000 L[2]。韓國，CBN生物科技公司，每年生產(chǎn)大約40～45 t人參不定根，這是一個利用植物組織培養(yǎng)生產(chǎn)藥品、食品和化妝品的成功范例。主要研究了培養(yǎng)條件的優(yōu)化和誘導(dǎo)子的使用來提高次級代謝產(chǎn)物的含量。由WHO資助的半合成青蒿素已經(jīng)被賽諾菲公司研制成功，其用發(fā)酵方法由單糖生產(chǎn)的青蒿酸在2013年已形成60 t左右產(chǎn)能。Phyton為成為世界經(jīng)驗豐富的高品質(zhì)紫杉醇生產(chǎn)商已進行了巨額投資。我國具有通過植物細胞發(fā)酵生產(chǎn)紫杉醇的巨大a能，杜絕了對紫杉樹種植的依賴，也避免了他們與環(huán)境、可持續(xù)性、性和質(zhì)量穩(wěn)定性相關(guān)的固有問題。近年來藥用植物細胞，毛狀根和不定根次級代謝產(chǎn)物的積累情況見表1。

近年來，藥用植物細胞，毛狀根和不定根培養(yǎng)受到了廣泛關(guān)注，因為它提供了許多植物次級代謝產(chǎn)物。總的來說，藥用植物的細胞，毛狀根和不定根是逐年增加的，并且它的培養(yǎng)規(guī)模已經(jīng)逐漸擴大。

2 遺傳多樣性分析

植物組織培養(yǎng)是植物快速大量增值的一種潛在工具，并且有利于控制重要次級代謝產(chǎn)物的生成。然而再生植株的遺傳基因會發(fā)生一定程度的變異，從而造成植株化學(xué)成分的改變及其臨床療效的差異，影響組織培養(yǎng)的優(yōu)點[40]。因此，必須保障組培植株基因的一致性，以確保植株的質(zhì)量。用于監(jiān)測遺傳基因變化的方法有簡單重復(fù)序列，隨機擴增多態(tài)性DNA和相關(guān)序列擴增多態(tài)性。

簡單重復(fù)序列通常形成具有具體基因，少許具體標記物的種族。隨機擴增多態(tài)性DNA方法是一種PCR技術(shù)，隨機擴增DN段，使用低于低退火溫度的核苷酸序列的單一引物。這個技術(shù)已經(jīng)廣泛用于種族分類，遺傳作圖和種系發(fā)生[41-42]。在吊燈花屬快繁的研究中，在植株的直接芽器官發(fā)生，間接芽器官發(fā)生和母本植物之間比較基因穩(wěn)定性，結(jié)果顯示通過簡單重復(fù)序列和隨機擴增多態(tài)性DNA方法，直接芽器官發(fā)生的基因和母本植物是相似的，間接芽器官發(fā)生的隨機擴增多態(tài)性DNA指紋圖譜顯示出低的變異率[40]。相關(guān)序列擴增多態(tài)性是簡單的有效地生產(chǎn)高再生性和多功能性的全組基因片段。在人參懸浮細胞培養(yǎng)中，通過隨機擴增多態(tài)性DNA方法在懸浮細胞與幼苗之間比較基因穩(wěn)定性，結(jié)果顯示懸浮細胞的基因和幼苗是相似的[43]。在擬南芥懸浮細胞培養(yǎng)中，通過簡單重復(fù)序列方法來比較懸浮細胞和擬南芥植株的基因穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)懸浮細胞的基因和幼苗是相似的[44]。

3 道地藥材

道地性歸根結(jié)底是道地藥材所擁有的基因型受到特定生境（道地產(chǎn)區(qū)）中環(huán)境因子誘導(dǎo)后表達的產(chǎn)物。因此，基因表達是道地藥材研究的重要環(huán)節(jié)，而功能基因表達的調(diào)控是道地藥材研究的目標之一[45]。揭示道地藥材和非道地藥材在基因表達方面的差異是道地藥材功能基因研究的重要內(nèi)容。由于基因表達對研究所用RNA材料的要求較高，且通常需要通過對比實驗來完成，造成道地藥材基因表達及調(diào)控實驗?zāi)壳爸饕性趯嶒炇抑小Ｓ捎诩毎囵B(yǎng)和組織培養(yǎng)周期較短，材料易于獲得，均勻性較好，因此道地藥材功能基因表達與調(diào)控研究多是在植物組織和細胞中開展[46]。

例如，黃新等[47]利用mRNA差異顯示技術(shù)研究茉莉酸甲酯對紅豆杉細胞mRNA表達的差異。李娟等[48]考察了碳源、氮源、有機成分對HBsAg轉(zhuǎn)基因人參細胞生長和HBsAg表達量的影響。劉峻等[49]研究了真菌誘導(dǎo)子影響人參毛狀根總皂苷的合成量。以上研究，雖然距離真正的實現(xiàn)道地藥材功能基因的表達和調(diào)控尚有一段距離，但為道地藥材功能基因表達和調(diào)控研究積累了思路和方法。

4 誘導(dǎo)子作用機制及其應(yīng)用

4.1 誘導(dǎo)子的作用機制

誘導(dǎo)子被植物細胞膜或細胞質(zhì)中的接受體識別后，細胞膜便開始去極化，引起離子通道的開閉，如Ca2+從環(huán)境中流入細胞質(zhì)，K+和Cl-流出，或者通過 G 蛋白偶聯(lián)，激活第二信使系統(tǒng)，進一步的擴大這種效應(yīng)，產(chǎn)生植物防御分子，如鈣離子（Ca2+）、活性氧（ROS）、水楊酸（SA）、茉莉酸（JA）、一氧化氮（NO）、乙烯（ET）等，進而引起下游防衛(wèi)基因的表達，改變相關(guān)酶的活性，并最終導(dǎo)致次級代謝產(chǎn)物的積累，見圖1[50]。

4.1.1 細胞內(nèi)信號分子和作用機制 植物細胞信號分子主要作用偶合各種胞內(nèi)外刺激，包括生物或者非生物刺激，再通過細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)系統(tǒng)使得刺激和細胞間信號級聯(lián)放大，最終導(dǎo)致相關(guān)酶活性的改變，進而引起一系列生理生化反應(yīng)。例如，誘導(dǎo)子刺激后，細胞質(zhì)中鈣離子（Ca2+） 濃度的升高、一氧化氮合成、活性氧迸發(fā)、茉莉酸合成途徑激活等，誘導(dǎo)防御基因的開啟，刺激代謝途徑中關(guān)鍵酶的合成，最終促進植物次級代謝產(chǎn)物的合成[51]。

鈣離子：誘導(dǎo)子刺激后，植物細胞在短時間內(nèi)出現(xiàn)離子流，如Ca2+和H+從環(huán)境中流入細胞質(zhì)，K+和Cl-流出等。這些Ca2+可以驅(qū)動鈣離子受體鈣調(diào)蛋白（CaM）的反應(yīng)，一旦鈣調(diào)蛋白激活后，可以進一步激活與鈣調(diào)蛋白相關(guān)的蛋白激酶，從而引發(fā)蛋白的磷酸化，進而引起防御基因的表達[90]。例如，Ca2+含量迅速上升后，激活鈣調(diào)蛋白，會使大量的NAD（P）H氧化酶被激活，NADPH氧化酶可以催化過氧化物的產(chǎn)生和積累，從而進一步引起并下游一系列的反應(yīng)，刺激次級代謝物的積累[52]。Ca2+內(nèi)流以后，可作為信號分子激活磷脂酸 C，進而使磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸（PIP2）水解產(chǎn)生 2 個第二信使： IP3（三磷酸肌醇）和 DAG（甘油二酯）。其中，DAG 可以與蛋白激酶結(jié)合，激活蛋白激酶 C，從而觸發(fā)蛋白磷酸化信號級聯(lián)，引起細胞內(nèi)代謝物的積累。IP3 可以與細胞內(nèi)鈣庫（如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、葉綠體、液泡等）上的鈣離子通道受體結(jié)合，進而動員細胞內(nèi)鈣庫中鈣離子的釋放。IP3-Ca2+信號途徑被認為是誘導(dǎo)植物抗毒素產(chǎn)生的調(diào)節(jié)物質(zhì)[53]。在長春花懸浮細胞過程中加入真菌粗提物作為誘導(dǎo)子時，IP3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑被激活，從而進一步使長春花細胞中生物堿的含量提高[54]。

活性氧：植物防御早期的另一個重要變化是活性氧的迸發(fā)現(xiàn)象。活性氧濃度升高可以作為第二信使引發(fā)胞內(nèi)一系列抗性反應(yīng)，如可以促進結(jié)構(gòu)蛋白和木質(zhì)素的合成使細胞壁增厚，細胞超敏死亡等，另外，活性氧介導(dǎo)的脂質(zhì)氧化可以刺激茉莉酸及相關(guān)化合物的合成，誘導(dǎo)次級代謝防御基因和次生代謝物合成基因的表達，進而誘導(dǎo)次級代謝[55]。在紅豆杉細胞培養(yǎng)過程中，經(jīng)尖孢鐮刀菌的細胞壁粗提物誘導(dǎo)后，紅豆杉細胞中活性氧大量積累，最終會導(dǎo)致細胞中紫杉醇的含量顯著上升，與對照相比提高了近4倍[56]。但是高濃度的活性氧，如 O2-，H2O2，OH-，1O2會損傷細胞內(nèi)的成分。抗氧化酶體系，如超氧化物歧化酶 （SOD）、過氧化物酶 （POD）以及過氧化氫酶 （CAT）等，會被激活，從而減輕活性氧的毒性作用，增強植物的耐受性[57]。在丹參細胞培養(yǎng)過程中，Dong等[58]發(fā)現(xiàn)在丹參細胞培養(yǎng)基中加入水楊酸，酚類化合物的含量會顯著增加，同時抗氧化物酶SOD，POD，CAT 的活性也會增加。

茉莉酸類：在許多的植物細胞培養(yǎng)體系中，誘導(dǎo)子都可以誘導(dǎo)內(nèi)源的茉莉酸類物質(zhì)的合成，其可作為細胞內(nèi)和細胞間的信號分子，與轉(zhuǎn)錄因子相互作用，進而調(diào)節(jié)防御基因的表達，最終導(dǎo)致次生代謝物質(zhì)的合成[59]。茉莉酸類也可以刺激次級代謝產(chǎn)物合成相關(guān)的基因的表達，從而促進一系列次級代謝產(chǎn)物的合成，包括萜類物質(zhì)、黃酮類物質(zhì)、生物堿和苯丙烷類物質(zhì)[50]。在貫葉連翹細胞懸浮培養(yǎng)過程中，在培養(yǎng)基中加入黑曲霉細胞壁的粗提物作為誘導(dǎo)子時，茉莉酸的合成量迅速增加，同時細胞中金絲桃素的含量也迅速增加，而加入茉莉酸合成抑制劑后，細胞中金絲桃素的含量顯著下降[57]。

一氧化氮和水釧幔涸謐勻喚韁校水楊酸（SA）是植物與病原菌相互作用的誘導(dǎo)物，它能夠誘導(dǎo)發(fā)病機制相關(guān) （PR） 基因的表達及和致病相關(guān)蛋白的產(chǎn)生，但是，水楊酸不是存在于所有植物防御代謝中[1]。研究發(fā)現(xiàn)，在部分植物的細胞中，水楊酸的迅速合成，可以誘導(dǎo)一些與代謝相關(guān)基因的表達，促使一些次生代謝產(chǎn)物的積累，例如，在茜草的培養(yǎng)過程中，SA可以增加細胞中蒽醌類物質(zhì)的積累[60]。一氧化氮（NO）作為信號化合物，近年來才逐漸被認識。在植物體內(nèi)，NO可以通過一氧化氮合成酶（NOS）、硝酸鹽還原酶（NR）或者非酶促反應(yīng)來合成[59]。轉(zhuǎn)錄組測序的結(jié)果表明，NO處理后，可以引起植物細胞內(nèi)與壓力和抗病性相關(guān)的基因的表達，說明了NO信號途徑可能與細胞內(nèi)的次生代謝相關(guān)[61]。另外，NO還可以作用于水楊酸（SA）等信號分子的上游，參與和調(diào)控植物細胞中SA等信號分子的生物合成[62]。

真菌分泌物T導(dǎo)子是指將真菌的發(fā)酵液收集后，用4層紗布進行過濾，1萬×g 離心20 min后，用0.4 μm的濾膜進行過濾，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀把過濾后的發(fā)酵液濃縮到一定體積，放入滅菌鍋中121 ℃滅菌25 min。一般將滅活菌體發(fā)酵液在一定時間加入植物培養(yǎng)物培養(yǎng)基，處理一定時間來誘導(dǎo)植物培養(yǎng)物的生長以及次級代謝產(chǎn)物的積累。真菌分泌物體作為誘導(dǎo)子在植物組織培養(yǎng)中的應(yīng)用，見表4。

4.2.3 非生物誘導(dǎo)子在植物組織培養(yǎng)中的應(yīng)用 水楊酸（SA）和茉莉酸類化合物 [茉莉酸（JA），茉莉酸甲酯（MJ）]由于可以通過誘導(dǎo)多種植物次級代謝產(chǎn)物合成途徑中基因的表達來促進次級代謝產(chǎn)物含量的增加而廣為人知。除此之外，由于他們可以在低濃度誘導(dǎo)遠離他們合成部分的細胞反應(yīng)，又被成為植物激素。其中，茉莉酸甲酯類應(yīng)用最廣泛，目前已經(jīng)成功應(yīng)用于人參、柴胡、百部、甘草、西洋參、匙羹藤、柴胡、紫錐菊、雷公藤、睡茄、刺五加、苦艾和積雪草等植物組織培養(yǎng)中來提高細胞中次級代謝物的含量。

在苦艾懸浮細胞培養(yǎng)中，添加1.0 mg?L-1的茉莉酸以及茉莉酸甲酯可以使其總酚，總黃酮的含量增加，另外，可以提高自由基清除能力[97]。加入10 mg?L-1的茉莉酸甲酯到人參不定根的培養(yǎng)液中，人參皂苷約32 mg?g-1是空白組的4.76倍[98]。

化學(xué)合成誘導(dǎo)子一般指的是對已知的誘導(dǎo)子進行改造，通過化學(xué)合成，在誘導(dǎo)子分子結(jié)構(gòu)上加入一些官能團等，來提高誘導(dǎo)子的誘導(dǎo)能力，增加藥用植物細胞中次級代謝物的積累。其中，最常見的是對茉莉酸甲酯的改造。例如，在三七懸浮細胞的培養(yǎng)過程中加入五氟丙基茉莉酸甲酯、2-羥乙基茉莉酸甲酯以及2-羥基乙氧基乙基，結(jié)果發(fā)現(xiàn)他們都能顯著增加人參皂苷的含量[99]。Qian等[100]考察了2-羥乙基茉莉酸甲酯和三氟乙基茉莉酸甲酯對紅豆杉細胞中次級代謝產(chǎn)物的誘導(dǎo)作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2-羥乙基茉莉酸甲酯和三氟乙基茉莉酸甲酯能顯著提高紅豆杉細胞中紫杉烷C的含量，質(zhì)量分數(shù)分別達到44.3，39.7 mg?g-1，均高于對照組（茉莉酸甲酯處理組）的含量（質(zhì)量分數(shù)分別為14.0，32.4 mg?g-1）。

除了常用的上述這些化合物外，還有一些物理因子如紫外光、溫度、超聲，金屬離子，水分，pH，鹽強，氣體如臭氧、一氧化氮、過氧化氫、二氧化碳、乙烯等都能提高次級代謝產(chǎn)物的含量。

5 生物合成生產(chǎn)藥用植物活性成分

由于生長受到自然環(huán)境的影響，許多藥用植物生長緩慢或栽培機制復(fù)雜。中藥材中的活性成分存在含量低、結(jié)構(gòu)復(fù)雜、不穩(wěn)定、很難化學(xué)合成或產(chǎn)率地下等缺點。利用生物技術(shù)生產(chǎn)活性成分有許多優(yōu)點：包括生長周期短、生產(chǎn)標準化、質(zhì)量穩(wěn)定等，為中藥資源保護提供了新的途徑。隨著生物合成技術(shù)在青蒿素、紫杉醇，丹參酮和人參皂苷生物合成研究中的應(yīng)用，預(yù)測生物合成技術(shù)將成為中藥可持續(xù)利用的重要途徑之一。近年來利用生物合成來生產(chǎn)活性成分的例子見表5。

藥用植物有效成分的生物合成是在基因組學(xué)的研究基礎(chǔ)上，通過在細胞中構(gòu)建有效成分的生物合成途徑和代謝網(wǎng)絡(luò)，從而實現(xiàn)藥用有效成分的定向、高效的合成，以解決藥用有效成分的生產(chǎn)及藥物研發(fā)等一系列問題[52]。植物組織培養(yǎng)在生物合成中的應(yīng)用包括功能基因的挖掘和基因功能體內(nèi)驗證。

基因功能基因的挖掘主要是通過轉(zhuǎn)錄組測序來實現(xiàn)的。Subramaniyam等[101]對MJ處理不同時間的人參不定根進行了轉(zhuǎn)錄組測序，發(fā)現(xiàn)30個轉(zhuǎn)錄因子，11個GT與人參皂苷合成有關(guān)。Nuruzzaman等[102]對MJ處理過的人參不定根以及未處理過的不定根進行測序，發(fā)現(xiàn)48個轉(zhuǎn)錄因子與人參皂苷的合成相關(guān)。Jayakodi等[103]對2種人參材料誘導(dǎo)出的不定根以及栽培人參進行了轉(zhuǎn)錄組測序，發(fā)現(xiàn)不定根中90%的基因與數(shù)據(jù)庫得到一致，17%的基因是栽培品中所沒有的，此外還發(fā)現(xiàn)了一些與人參皂苷合成相關(guān)的候選功能基因。

基因功能的體內(nèi)驗證主要是通過在植物組織培養(yǎng)器官體內(nèi)進行基因沉默以及過表達來實現(xiàn)的。Park等[104]通過把CYP716A53v2基因在PCR 8.0中進行克隆，然后與pH2WG連接構(gòu)建過表達載體，然后導(dǎo)入農(nóng)桿菌中，侵染人參胚狀體，經(jīng)過篩選得到CYP716A53v2過表達根系；另一方面，把CYP716A53v2基因進行沉默，構(gòu)建相應(yīng)的沉默載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌中繼而侵染人參胚狀體，經(jīng)過篩選得到CYP716A53v2沉默根系。研究發(fā)現(xiàn)，過表達根系中CYP716A53v2基因的表達以及原人參三醇類皂苷含量高于正常根系，沉默根系中CYP716A53v2基因的表達以及原人參三醇類皂苷含量低于正常根系，說明CYP716A53v2基因的功能是轉(zhuǎn)化原人參二醇為原人參三醇。

植物組織培養(yǎng)論文:植物組織培養(yǎng)課程改革與實踐研究

摘要：本文把傳統(tǒng)的知識教學(xué)體系下的《植物組織培養(yǎng)》教學(xué)內(nèi)容進行重構(gòu)，從教學(xué)內(nèi)容的設(shè)計、教學(xué)方法與手段以及課程考核等方面進行了改革，突出實踐性和技能性，取得了良好的教學(xué)效果。

關(guān)鍵詞：植物組織培養(yǎng)；教學(xué)改革；實踐研究

植物組織培養(yǎng)是20 世紀初發(fā)展起來的一門新技術(shù)，是現(xiàn)代生物技術(shù)的重要組成部分，經(jīng)過幾十年的發(fā)展已經(jīng)廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、林業(yè)、工業(yè)與醫(yī)藥業(yè)中，尤其是在苗木脫毒、快速繁殖、新品種培育、植物次生代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)等方面發(fā)揮著重要的作用，并創(chuàng)造了巨大的經(jīng)濟效益與社會效益[1]，這使得近些年試管苗在國內(nèi)外市場上已形成產(chǎn)業(yè)化，因而需要大量實踐能力強的植物組織培養(yǎng)技術(shù)技能型人才。《植物組織培養(yǎng)》課程具有很強的專業(yè)性和實踐性，它對農(nóng)林類高職學(xué)生實踐能力、創(chuàng)新能力和創(chuàng)業(yè)能力的培養(yǎng)，對產(chǎn)學(xué)研結(jié)合以及為農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)和地方經(jīng)濟建設(shè)服務(wù)具有重要的現(xiàn)實意義[2]。本課程教學(xué)圍繞植物組織培養(yǎng)工作崗位所需知識、能力及實際工作任務(wù)需要，重新構(gòu)建了教學(xué)內(nèi)容。培養(yǎng)學(xué)生掌握培養(yǎng)基成分、功能、無菌操作流程以及提高試管苗成活率措施等知識目標，達到學(xué)習(xí)儀器使用維護、培養(yǎng)基制備、無菌操作、試管苗移栽等基本能力目標，以及愛崗敬業(yè)、熱愛組培事業(yè)、團隊協(xié)作的基本素質(zhì)目標。

1 課程改革的思路

課程組人員通過調(diào)研得知，從事植物組織培養(yǎng)工作的學(xué)生初次就業(yè)從事的工作任務(wù)，主要是進行培養(yǎng)基制備（母液配制）、無菌操作及組培苗培養(yǎng)、組培苗的移栽與管理，這也是植物組織培養(yǎng)的核心能力。所以，在進行課程改革的過程中，瞄準組織培養(yǎng)4個典型工作任務(wù)，即母液配制、培養(yǎng)基制備、無菌操作及組培苗培養(yǎng)、組培苗的移栽與管理來確定培養(yǎng)目標，對學(xué)生技能進行反復(fù)熟練、反復(fù)強化。在教學(xué)內(nèi)容設(shè)計過程中，基于北方園藝果蔬花卉典型工廠化產(chǎn)品馬鈴薯、藍莓、蝴蝶蘭的生產(chǎn)項目為主體，重構(gòu)課程內(nèi)容。培養(yǎng)學(xué)生自主獲取信息、自主制定工作方案、自主完成組織培養(yǎng)中的典型工作任務(wù)、并能夠?qū)^程進行檢查。總體思路為“一抓，二做，三融入”，即教師抓1個典型的項目，學(xué)生做2個典型的任務(wù)，融入理論、科研和大賽。內(nèi)容設(shè)計從簡單到復(fù)雜至再提升的三級教學(xué)目標。

2 課程內(nèi)容的設(shè)計

本課程把以往按照章節(jié)講授緒論、實驗室的構(gòu)建和操作技術(shù)等七章內(nèi)容，按照典型工作任務(wù)和典型生產(chǎn)項目把相關(guān)的內(nèi)容進行整合，結(jié)合本專業(yè)的特點設(shè)計4個大的項目，9個子項目（見表1），規(guī)避了以往專業(yè)性不強，學(xué)生操作能力弱，教學(xué)內(nèi)容重復(fù)的弊端，教師在每類大項目中講解一個子項目，在教師指導(dǎo)下學(xué)生完成第二個子項目，學(xué)生自主完成第三個子項目，并提交項目成果。拓展項目不占用課內(nèi)學(xué)時，教學(xué)內(nèi)容設(shè)計重復(fù)的是步驟，而不是內(nèi)容，難度增加，能力逐漸遞進。

3 教學(xué)方法與手段改革

本門課程在實施過程中圍繞藍莓、蝴蝶蘭、馬鈴薯，采用項目教學(xué)、任務(wù)驅(qū)動、真崗實練等教學(xué)方法，以及多媒體教學(xué)、現(xiàn)場教學(xué)、課上課下相結(jié)合等教學(xué)手段。在教學(xué)過程中，利用QQ群、微信發(fā)任務(wù)，學(xué)生利用課余時間自主預(yù)習(xí)和準備教師發(fā)放的資料及任務(wù)清單，各個小組根據(jù)任務(wù)清單內(nèi)容自己準備用具并清洗干凈。課內(nèi)教學(xué)，首先教師利用多媒體教學(xué)講解基本知識點、重點和難點，利用網(wǎng)絡(luò)教學(xué)播放視頻資料，用示范教學(xué)法教師演示標準的操作技能。然后進入實操環(huán)節(jié)發(fā)放生產(chǎn)任務(wù)單和考核標準。采用小組討論、任務(wù)啟發(fā)的方法讓學(xué)生填寫生產(chǎn)任務(wù)單，教師檢查正確后開始進行操作，操作過程參照詳細的考核標準。整個實操環(huán)節(jié)教師在現(xiàn)場進行巡回指導(dǎo)，并糾正學(xué)生操作過程中出現(xiàn)的技術(shù)問題，要對本次課程進行總結(jié)與評價，學(xué)生小組互評需要改M的方面，教師進行總結(jié)，指出在本次課程中出現(xiàn)的問題。課后拓展采用上屆帶下屆的方式，成立課外興趣小組進行相關(guān)內(nèi)容的課后任務(wù)。

4 課程考核

對于課程的總體考核采用理論考核+過程考核+大賽模擬考核的方式進行，要想技能有提升，理論知識必須要扎實，理論考核占總成績的30%，主要考核植物組織培養(yǎng)基礎(chǔ)的知識和技能點。過程考核中包括平時成績、項目成果、現(xiàn)場操作三部分，平時成績占總成績10%，主要包括出勤、提問發(fā)言、實訓(xùn)準備等，每個項目的成果占總成績的20%，每個項目最終要提交成活的試管苗、項目總結(jié)報告。現(xiàn)場操作占總成績的20%，主要是小組互評和教師評價，以教師評價為主。大賽模擬是按照國賽“植物組織培養(yǎng)”賽項的標準和要求進行，主要有三部分內(nèi)容：MS母液配制、MS培養(yǎng)基制備、馬鈴薯組培苗的繼代培養(yǎng)，成績占總成績的20%。

作者簡介：張彩玲，碩士，副教授，研究方向：植物組織培養(yǎng)。

植物組織培養(yǎng)論文:論植物組織培養(yǎng)褐變產(chǎn)生的因素及對策

摘要:本文針對植物組織培養(yǎng)中常見的褐變現(xiàn)象,詳細地分析了其產(chǎn)生的機理及影響因素,并提出了相應(yīng)的對策,為科研和生產(chǎn)提供了一定的理論和實踐依據(jù)。

關(guān)鍵詞:植物組織培養(yǎng)，褐變，對策

目前，在許多植物組織培養(yǎng)過程中，常遇到褐變問題。褐變主要發(fā)生在外植體，在植物愈傷組織的繼代、懸浮細胞培養(yǎng)以及原生質(zhì)體的分離與培養(yǎng)中也經(jīng)常發(fā)生。褐變產(chǎn)物不僅使外植體、細胞、培養(yǎng)基等變褐，而且對許多酶有抑制作用，從而影響培養(yǎng)材料的生長與分化，嚴重時甚至導(dǎo)致死亡。本文探討植物組織培養(yǎng)中褐變現(xiàn)象的影響因素、機理及防范措施，對我們進行科學(xué)研究或工廠生產(chǎn)，包括植物組織的培養(yǎng),原生質(zhì)體、懸浮細胞和植物器官的培養(yǎng)都有著十分重要的現(xiàn)實意義。

1褐變產(chǎn)生的影響因素

影響植物組織培養(yǎng)褐變的因子是復(fù)雜的，因植物的種類、基因型、外植體部位及生理狀態(tài)等不同，褐變的程度也有所不同。

1.1植物種類及基因型不同的植物和不同的基因型決定了不同的褐化程度。在組織培養(yǎng)中，品種褐化難易可能是與該品種中多酚類物質(zhì)含量的多少及多酚氧化酶(PPO)活性的差異有關(guān)。

1.2外植體部位及生理狀態(tài)外植體的部位及生理狀態(tài)不同其褐化程度不同，同時，不同時期和不同年齡的外植體在培養(yǎng)中褐變的程度也不同。

1.3培養(yǎng)基成分培養(yǎng)基成分中的無機鹽、蔗糖濃度、激素水平等對褐變的程度的影響尤為重要。另外，其pH值也與褐變程度有較大關(guān)系。

1.4培養(yǎng)條件溫度過高或光照過強，均可加速被培養(yǎng)組織的褐變。不利環(huán)境條件都能造成細胞的程序化死亡，溫度是誘導(dǎo)程序化死亡的主要因素[1]。

2褐變產(chǎn)生的機理

2.1非酶促褐變

非酶促褐變是由于細胞受脅迫或其他不利條件影響所造成的細胞程序化死亡或自然發(fā)生的細胞死亡，即壞死形成的褐變現(xiàn)象，并不涉及酚類物質(zhì)的產(chǎn)生。徐振彪等[1]將生長正常的愈傷組織轉(zhuǎn)移到含NaCl的培養(yǎng)基中，組織周圍尤其是接觸培養(yǎng)基部分發(fā)生褐變，但培養(yǎng)基中沒有看到擴散的褐化物質(zhì)。當(dāng)溫度升高時繼代保存時間過長，也會發(fā)生此類現(xiàn)象。但這種褐變?nèi)舨扇∵m當(dāng)措施或者愈傷組織適應(yīng)了脅迫環(huán)境就不再發(fā)生了[3]。

2.2酶促褐變

目前認為植物組織培養(yǎng)中的褐變主要是由酶促褐變引起的，培養(yǎng)材料變褐主要是由傷口處分泌的酚類化合物引起的[4]。酶促褐變?nèi)缤话愕拿复俜磻?yīng)，其發(fā)生必須具備三個條件，即酶、底物和氧。引起褐變的酶有多酚氧化酶(PPO)、過氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶等。從初次培養(yǎng)和繼代培養(yǎng)過程中試管苗的褐變程度和PPO的活性來看，表明PPO活性的高低是引起培養(yǎng)材料褐變的關(guān)鍵。引起褐變的酶的底物主要是酚類化合物，按其組成可分成3類:苯基羧酸（包括鄰羥基苯酚、兒茶酚、沒食子酸、莽草酸等），苯丙烷衍生物（包括綠原酸、肉桂酸、香豆酸、咖啡酸、單寧、木質(zhì)素等），第三類是黃烷衍生物（包括花青素、黃酮、蕓香苷等），但并非所有的酚類物質(zhì)都是PPO的底物。

在正常發(fā)育的植物組織中,底物、氧氣、PPO同時存在并不發(fā)生褐變，是因為在正常的組織細胞內(nèi)由于多酚類物質(zhì)分布在細胞的液泡內(nèi)，而PPO則分布在各種質(zhì)體或細胞質(zhì)中，這種區(qū)域性分布使底物與PPO不能接觸。而當(dāng)細胞膜的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化和破壞時，則為酶創(chuàng)造了與PPO接觸的條件，在氧存在的情況下使酚類物質(zhì)氧化成醌，進行一系列的脫水、聚合反應(yīng)，形成黑褐色物質(zhì)，從而引起褐變。

3防止外植體產(chǎn)生褐變的對策

從理論上講,酶促褐變可以通過以下三種方法加以抑制:一是除去引起氧化的物質(zhì)——氧；二是捕捉或減少聚合反應(yīng)的中間產(chǎn)物；三是抑制有關(guān)的酶。實際操作上，下列措施是被認為行之有效的。

3.1適當(dāng)外植體的選擇

取材時應(yīng)注意選擇褐變程度較小的品種和部位作外植體。成年植株比幼苗褐變程度厲害，夏季材料比冬季及早春和秋季材料的褐變要嚴重。冬季的芽不易生長，宜選用早春和秋季的材料作為外植體。王異星[5]用荔枝無菌苗不同組織的誘導(dǎo)試驗表明，莖最容易誘導(dǎo)出愈傷組織，培養(yǎng)2周后長出淺黃色的愈傷組織；葉大部分不能產(chǎn)生愈傷組織或誘導(dǎo)出的愈傷組織中度褐變；而根極大部分不產(chǎn)生愈傷組織，誘導(dǎo)出的愈傷組織全部褐變。

3.2對外植體的處理

通過對較易褐變的外植體材料的預(yù)處理能減輕醌類物質(zhì)的毒害作用。處理方法如下：外植體經(jīng)流水沖洗后，在2-5℃的低溫下處理12-24小時，再用升汞或70酒精消毒，然后接種于只含有蔗糖的瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)5-7天，使組織中的酚類物質(zhì)部分滲入培養(yǎng)基中。取出外植體用0.1漂白粉溶液浸泡10分鐘，再接種到合適的培養(yǎng)基中。若仍有酚類物質(zhì)滲出，3-5天后再轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基2-3次，當(dāng)外植體的切口愈合后，酚類物質(zhì)減少，這樣可使外植體褐變減輕或被抑制。何瓊英等[6]用抗壞血酸預(yù)處理香蕉吸芽外植體，能減輕外植體褐變，從而提高芽叢誘導(dǎo)率。

3.3適宜的培養(yǎng)基

培養(yǎng)基的成分與褐變程度有關(guān)，要考慮所選培養(yǎng)基的狀態(tài)和類型。

3.3.1適當(dāng)?shù)臒o機鹽濃度張妙霞等[7]在柿樹組織培養(yǎng)防止褐變所進行的試驗中，4種培養(yǎng)基的無機鹽以改良MS(大量元素減半)和1/2MS的效果好，MS的效果較差，結(jié)果證明低濃度的無機鹽可促進外植體的生長與分化，減輕外植體褐變的程度。徐振彪[1]在對玉米幼胚耐NaCl愈傷組織的篩選表明，隨NaCl濃度升高，褐變現(xiàn)象加重。

3.3.2適當(dāng)和適量的激素王異星[5]在荔枝的組織培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基中添加1mg/LBA 0.5mg/L2,4-D時，愈傷組織較堅硬，增殖緩慢，易產(chǎn)生褐變。培養(yǎng)基中添加1mg/LBA 1mg/L2,4-D時，愈傷組織淺黃疏松，增殖也快。

3.3.3培養(yǎng)基的硬度在一定范圍內(nèi)，瓊脂用量大，培養(yǎng)基硬度大，褐變率低[8]，這可能是培養(yǎng)基的硬度影響了酚類物質(zhì)的擴散速度的緣故。

3.3.4培養(yǎng)基中水的硬度的影響硬度低的蒸餾水褐變率低,而使用硬度較高的自來水,褐變嚴重,甚至?xí)霈F(xiàn)褐變死亡[8]。這可能是配制培養(yǎng)基的水改變了培養(yǎng)基中無機鹽的濃度,間接地影響了植物外植體的褐變。

3.3.5培養(yǎng)基的pH值在水稻體細胞培養(yǎng)中，pH值為4.5-5.0時MS液體培養(yǎng)基可保持愈傷組織處于良好的生長狀態(tài)，其表面呈黃白色，而pH值為5.5-6.0時，愈傷組織嚴重褐變[9]。一般來說，酸性環(huán)境(pH值為4.5-5.0)不利于褐變過程的發(fā)生[10]。

3.3.6培養(yǎng)條件如溫度過高或光照過強，光照會提高PPO的活性，促進多酚類物質(zhì)的氧化，從而加速被培養(yǎng)的組織褐變。高濃度CO2也會促進褐變，其原因是環(huán)境中的CO2向細胞內(nèi)擴散，細胞內(nèi)CO32-增多，CO32-與細胞膜上的CO32-結(jié)合，使有效CO32-減少，導(dǎo)致內(nèi)膜系統(tǒng)瓦解，酚類物質(zhì)與PPO相互接觸，產(chǎn)生褐變[11]。因此，初期培養(yǎng)要在黑暗或弱光下進行。

3.4添加褐變抑制劑和吸附劑

褐變抑制劑主要包括抗氧化劑和PPO抑制劑。在培養(yǎng)基中加入偏二亞硫酸鈉、L-半胱氨酸、抗壞血酸、檸檬酸、二硫蘇糖醇等抗氧化劑都可以與氧化產(chǎn)物醌發(fā)生作用，使其重新還原為酚[12]。由于其作用過程均為消耗性的，在實際應(yīng)用中應(yīng)注意添加量，其中L-半胱氨酸和抗壞血酸均對外植體無毒副作用，在生產(chǎn)應(yīng)用中可不受限制。在水稻細胞的培養(yǎng)基中，添加植酸(PA)，可防止褐變，PA分子中眾多的羥基產(chǎn)生抗氧化作用，使生色物質(zhì)的含量下降或PA與PPO分子中的Cu2 結(jié)合，從而降低了其活力。陳學(xué)森等[13]在對植酸在銀杏組織培養(yǎng)中應(yīng)用的研究中也證實了植酸具有抑制多酚氧化酶活性的作用。

常用的吸附劑有活性炭和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。活性炭是一種吸附性較強的無機吸附劑，能吸附培養(yǎng)基中的有害物質(zhì)，包括瓊脂中的雜質(zhì)、培養(yǎng)物在培養(yǎng)過程中分泌的酚、醌類物質(zhì)以及蔗糖在高壓消毒時產(chǎn)生的5-羥甲基糠醛等,從而有利于培養(yǎng)物的生長。粉末狀的活性炭與顆粒狀的活性炭相比吸附性更強，一般在培養(yǎng)基中加入1-4g/L的活性炭。在使用過程中應(yīng)注意，盡量用低濃度的活性炭來對抗褐變的產(chǎn)生，因為活性炭的吸附作用是沒有選擇性的，在吸附物質(zhì)的同時，也會吸附培養(yǎng)基中的其他成分，對外植體的誘導(dǎo)分化會產(chǎn)生一定的負面

影響[14]。而聚乙烯吡咯烷酮(PVP)是酚類物質(zhì)的專一性吸附劑，在生化制備中常用作酚類物質(zhì)和細胞器的保護劑，可用于防止褐變[15]。3.5進行細胞篩選和多次轉(zhuǎn)移

在組織培養(yǎng)過程中，經(jīng)常進行細胞篩選，可以剔除易褐變的細胞。在外植體接種1-2天后應(yīng)立即轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基中，能減輕酚類物質(zhì)對培養(yǎng)物的毒害作用，降低抑制作用，使外植體盡快分生，連續(xù)轉(zhuǎn)移5-6次，可基本解決外植體的褐變問題。

植物組織培養(yǎng)論文:高校植物組織培養(yǎng)實驗管理模式

摘要：高校植物組織培養(yǎng)實驗所應(yīng)用的實驗工具和儀器設(shè)備較多，實驗存在一定的危險性。加強對實驗的管理不僅能夠提高學(xué)生的實際操作能力，也能在很大程度上降低實驗的危險性。對高校植物組織培養(yǎng)實驗的管理模式進行探究，希望為今后的實驗管理工作提供理論上的支持。

關(guān)鍵詞：高校；植物組織培養(yǎng)實驗；管理模式

植物組織培養(yǎng)實驗是生命科學(xué)專業(yè)的重要實驗之一，該實驗?zāi)軌蚺囵B(yǎng)學(xué)生的應(yīng)用能力和思考能力，在實驗課程中占據(jù)重要的位置。植物組織培養(yǎng)實驗作為一項綜合性的實驗，所要應(yīng)用到的化學(xué)實劑、工具和實驗設(shè)備較多，其中不乏有毒有害、易燃易爆的物質(zhì)和高溫高壓的設(shè)備工具，如果操作不當(dāng)很容易發(fā)生危險，因此，必須加強對實驗的管理，提高實驗的完整性和安全性，保障實驗的順利進行。

1建立完善的實驗管理制度

在實驗開始之前，建立完善的管理制度，為實驗的進行提供保障。根據(jù)植物組織培養(yǎng)實驗的特點，可以建立組織培養(yǎng)室開放制度、儀器使用制度、藥品管理制度、安全制度、器皿清洗制度、登記制度、培訓(xùn)制度、消毒滅菌制度以及管理人員責(zé)任制度等，保障實驗的順利開展和有序進行。如在學(xué)期開始時，實驗教師可以為學(xué)生安排一次培訓(xùn)，為學(xué)生講解本學(xué)期需要完成的實驗以及在實驗過程中有哪些注意事項。安排學(xué)生參觀實驗室，使學(xué)生了解實驗的內(nèi)容和實驗室的規(guī)章制度，從而更好地投入到實驗學(xué)習(xí)中。

2加強實驗過程的管理

2.1實驗室的使用管理

由于不同的實驗教師對實驗的要求有所不同，其需要的實驗條件也有著很大的差別，而實驗室的空間和資源有限，實驗條件無法滿足每一位教師的要求。這就要求實驗技術(shù)管理人員對實驗室做出合理的安排，解決好實驗過程中出現(xiàn)的各種矛盾，提高實驗室的利用率，將實驗室的作用發(fā)揮到較大。在具體的管理工作中，可在實驗室門口張貼看板，詳細記錄實驗室的使用情況和實驗室內(nèi)部的各項參數(shù)，如光照情況、濕度、溫度等。也可以人為地創(chuàng)造實驗條件，如需要暗室培養(yǎng)時，可用遮光板將實驗室遮擋起來，人為創(chuàng)造一間暗室；在進行梯度培養(yǎng)時，由于所需的培養(yǎng)空間較小，可以使用培養(yǎng)箱來完成培養(yǎng)。將培養(yǎng)箱擺放在實驗室外的走廊上，擴展實驗室的使用空間，提高實驗室的使用率。同時也要根據(jù)教師和學(xué)生的時間靈活安排實驗，利用好實驗室的空當(dāng)，將實驗室的作用發(fā)揮到較大。

2.2儀器設(shè)備的管理

組織培養(yǎng)實驗室的設(shè)備具有種類多、使用頻率高的特點，如果沒有進行妥善的管理，很容易造成使用上的混亂，影響實驗的正常開展，因此，必須加強對實驗室儀器設(shè)備的管理，提高設(shè)備的利用率。在管理中，首先技術(shù)管理人員要定期對設(shè)備進行檢查，確保設(shè)備的性能處于正常的狀態(tài)，一旦發(fā)現(xiàn)設(shè)備故障，及時進行維修或更換，避免延誤實驗。其次，技術(shù)管理人員要做好設(shè)備的保養(yǎng)工作，按照使用說明定期對設(shè)備進行保養(yǎng)，延長設(shè)備的使用時間。另外，技術(shù)管理人員還要完成實驗室的清潔工作，保護實驗環(huán)境。每周對實驗室地面和臺面進行消毒，每2個月清洗空調(diào)過濾網(wǎng)，保障實驗?zāi)軌蛟跓o菌的條件下開展。

2.3預(yù)備實驗的管理

由于植物組織培養(yǎng)實驗所應(yīng)用到的實驗藥品較多，工作量較大，因此，在實驗開始之前，要充分做好準備工作。首先，將培養(yǎng)基藥品和其它藥品分開存放。培養(yǎng)基藥品包括微量元素、無機鹽、有機鹽以及激素類藥品，在存放上可以根據(jù)藥品的存放條件將這些藥品分柜存放，以免在取用時出現(xiàn)混亂。除培養(yǎng)基藥品外的其它藥品可按照其形態(tài)進行分類存放，將固體藥品和液體藥品來分，在每一種形態(tài)的藥品中又包含酸、堿、鹽、氧化物等不同性質(zhì)的藥品，這些藥品的存放也要做到區(qū)別對待。對于危險性較大的化學(xué)藥品，可采用雙人雙鎖的管理制度，以此來保障藥品的安全。對于一些常用實劑，如1mol/L的KOH溶液和HCL溶液來說，要安排專門的人員進行管理，定期完成溶液的配制工作。對于高壓滅菌鍋等數(shù)量較少的設(shè)備，可以進行登記管理，也可安排多人同時進行實驗，提高實驗設(shè)備的使用效率。

2.4實驗進行時管理

在學(xué)生完成實驗的過程中，教師要對其進行完整的監(jiān)督和管理，既要保障實驗的質(zhì)量，又要確保實驗的安全。在這一過程中，首先，要加強對學(xué)生的安全教育，提高學(xué)生的安全意識，使其了解到危險藥品所能帶來的危害，從根本上保障實驗的安全性。其次，教師要讓學(xué)生明確實驗的流程，嚴格按照領(lǐng)用制度進行實驗用品的領(lǐng)用，保障實驗?zāi)軌蛴行蜻M行。反復(fù)確認危險藥品的用途和用量，確保實驗的安全。另外，教師要確保每一個學(xué)生了解實驗操作規(guī)范，加強防范，采取必要的安全措施來保障學(xué)生的安全。保障實驗室防火、防漏器具的完整性，建立危險品記錄制度。

3積極改善實驗的環(huán)境

3.1加強教師隊伍的建設(shè)

教師隊伍承擔(dān)著教學(xué)和管理的任務(wù)，在實驗過程中起到了至關(guān)重要的作用，因此，必須不斷提升教師的素質(zhì)，使其更好地參與到植物組織實驗的教學(xué)和管理工作中去。由于實驗教學(xué)所涉及到的內(nèi)容較多，教學(xué)過程相對復(fù)雜，因此，教師必須要具備專業(yè)的素質(zhì)，完整的掌握實驗知識，保障教學(xué)的質(zhì)量。高校也要加強對教師的培訓(xùn)，使其不斷更新自己所掌握的知識，更好地完成教學(xué)工作。在培訓(xùn)的過程中，高校要做到以下幾點：一是有計劃地安排教師進行外出學(xué)習(xí)，使其能夠掌握先進的教學(xué)理念和教學(xué)知識，使教學(xué)工作能夠不斷獲得進步。二是優(yōu)化教學(xué)工作者的年齡構(gòu)成，加強對年輕教師的培訓(xùn)，提高雙師型教師的比例，優(yōu)化教師隊伍的構(gòu)成。三是加強對教師技術(shù)上的培訓(xùn)，如安排教師到設(shè)備公司完成設(shè)備知識的學(xué)習(xí)，以這種方式來提高教師的實際操作能力，提高設(shè)備的利用率。四是為教師搭建交流的平臺，使其能夠看到他人具備的優(yōu)勢，看清自身的不足，從而激勵教師不斷進行自我提升。五是開展學(xué)術(shù)交流會，聘請的教育工作者來校進行講座，使教師對當(dāng)前的教學(xué)現(xiàn)狀有所了解，不斷提高實驗教學(xué)的質(zhì)量。

3.2構(gòu)建學(xué)生交流平臺

組織培養(yǎng)實驗具有實驗步驟復(fù)雜、實驗周期長等特點，在操作上具有一定的難度。不論哪一個實驗步驟出現(xiàn)問題，都會對實驗結(jié)果造成巨大的影響，不僅會影響實驗的進度，也會造成資源上的大量浪費。構(gòu)建實驗交流平臺能夠使學(xué)生更加深入了解實驗步驟，掌握實驗的方法，減少錯誤的發(fā)生，達到事半功倍的效果。在具體實施上，可以定期組織學(xué)生進行學(xué)術(shù)交流，在學(xué)術(shù)交流過程中，教師要利用多媒體設(shè)備為學(xué)生展示實驗的過程和實驗中所要注意的事項，使學(xué)生更加直觀了解實驗的步驟，吸取前人的經(jīng)驗和教訓(xùn)。教師也可以讓學(xué)生閱讀中外文獻，了解國內(nèi)外的實驗進展情況，讓學(xué)生在學(xué)術(shù)交流會上完成交流，同時提出自己的問題，由教師統(tǒng)一解答。這種方式擴展了學(xué)生的視野，推動實驗工作的進一步發(fā)展。

3.3開放組織培養(yǎng)實驗室

將組織培養(yǎng)實驗室向?qū)W生（特別是本科生）開放，不僅能夠為學(xué)生實習(xí)實踐提供更好的物質(zhì)條件，也為學(xué)生創(chuàng)建了一個良好的學(xué)習(xí)空間。學(xué)生在完成課題研究的同時，也能夠完成學(xué)習(xí)任務(wù)，達到了實驗學(xué)習(xí)的目的。實踐表明，實驗室可以通過以下幾種模式向?qū)W生開放：3.3.1向所承擔(dān)的實驗課題開放。在這一過程中，教師可以借鑒國外的導(dǎo)師制度，讓學(xué)生依靠自己的能力完成相關(guān)課題的研究，提高學(xué)生的思考能力和實際操作能力。學(xué)生通過自己收集資料、查閱文獻，解決了相關(guān)問題，掌握正確的學(xué)習(xí)方法。另外，學(xué)生所得出的實驗數(shù)據(jù)也為教師提供了一些基礎(chǔ)性的研究參考，對教師的工作有很大幫助。目前，很多高校已經(jīng)開始實行一體化教學(xué)，將理論教學(xué)與實踐教學(xué)結(jié)合在一起，這種方式不僅激發(fā)了學(xué)生主動學(xué)習(xí)的熱情，也使學(xué)生的主觀能動性得到培養(yǎng)。3.3.2向畢業(yè)論文開放。畢業(yè)論文是教學(xué)的重要組成部分，也是檢驗學(xué)生實際能力的一種重要方式。如果學(xué)生的畢業(yè)論文涉及到植物組織培養(yǎng)的相關(guān)內(nèi)容，教師可以向其開放實驗室。在此過程中，教師可對學(xué)生進行實驗的前期指導(dǎo)，幫助學(xué)生找到適當(dāng)?shù)姆椒ǎ瑸閷W(xué)生提供便利的條件，使學(xué)生能夠更好的完成實驗操作，保障畢業(yè)論文的質(zhì)量。3.3.3要將實驗室向興趣小組開放。很多學(xué)生對實驗學(xué)習(xí)抱有很大的興趣，對于這樣的學(xué)生，教師可以讓其組成實驗興趣小組，一同完成數(shù)據(jù)收集、材料準備以及實驗操作等工作。實驗教師可以擔(dān)任興趣小組的指導(dǎo)教師，同時選擇能力較強的學(xué)生擔(dān)任小組長。在教師的指導(dǎo)下，學(xué)生通過查閱文獻確定自己的實驗項目，自己設(shè)計實驗過程。將所要進行的實驗高職實驗室管理教師，在得到教師的同意后方可開始實驗。在實驗的過程中，小組成員可就實驗中遇到的問題展開討論，找到正確的解決辦法，如果以個人的能力無法解決相關(guān)問題，可向指導(dǎo)教師進行咨詢。這樣一來，學(xué)生獲得了自主學(xué)習(xí)的空間，其鉆研、創(chuàng)新的精神也得到了很好的培養(yǎng)。3.3.4要為參賽學(xué)生開放實驗室。學(xué)生在校學(xué)習(xí)的過程中會面臨很多參賽的機會，這些比賽能夠鍛煉學(xué)生的能力，提高學(xué)生學(xué)習(xí)興趣，因此，高校要為參加比賽的學(xué)生提供實驗條件，使學(xué)生完成參賽前的準備工作。在這一過程中，高校可為學(xué)生安排專業(yè)較強的實驗教師作為其指導(dǎo)教師，幫助學(xué)生解決實驗過程中遇到的問題，對學(xué)生的實驗行為進行指導(dǎo)，保障實驗操作的標準性和實驗的性。在實驗學(xué)習(xí)的過程中，教師也可以讓學(xué)生以小組為單位進行比賽，豐富教學(xué)的形式，提高學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣。

4結(jié)語

植物組織培養(yǎng)實驗作為生命科學(xué)專業(yè)的重要實驗，具有實驗過程復(fù)雜、實驗藥品眾多的特點，因此必須加強對實驗的管理，提高實驗的效率。在管理中，要建立完善的管理制度、加強對實驗過程的管理、搭建完善的交流平臺、保障實驗合理有序的進行以及保障實驗的效果。

作者：張俊琦 單位：北京林業(yè)大學(xué)公共分析測實中心

植物組織培養(yǎng)論文:千里香植物組織培養(yǎng)的優(yōu)化

摘 要：千里香為我國較常見的藥用植物，有麻醉止痛，消腫解毒等功效。本實驗以其新生幼葉及莖段為外植體，通過優(yōu)化組織培養(yǎng)方法，篩選出適宜千里香生長的培養(yǎng)基體系，其中生長素的種類及含量對外植體的生長具有重要作用，同時，一定濃度的活性炭也可以有效地預(yù)防愈傷組織的褐化。經(jīng)大量試驗發(fā)現(xiàn)適合千里香生長的培養(yǎng)基為：MS +6-BA2.5mg/L+NAA0.5mg/L+活性炭0.5g/L；本次實驗旨在為千里香的無土大面積栽培提供新的方法和途徑，同時也為千里香在分子水平的研究提供無菌材料。

關(guān)鍵詞：千里香；組織培養(yǎng)；優(yōu)化；生長素

基金項目：廣西高校右江流域特色民族藥研究重點實驗室（xzdsysyy2015304）；2014年右江民族醫(yī)學(xué)院校級課題。

千里香（Murraya paniculata）又名七里香、萬里香，為蕓香科（Rutaceae）九里香屬（Murraya）植物，原名小葉九里香，1978年黃成就將小葉九里香上升為種，更名為千里香[1]。千里香因具有耐旱不耐寒的特性而廣泛分布于我國的廣西、云南等高海拔溫?zé)岢睗竦貐^(qū)，植物體為常綠灌木，具有麻醉止痛，活血散瘀等多種功效，是我國較常用的中草藥材。國內(nèi)外學(xué)者對千里香的研究較少，且多見于對其化學(xué)組份以及藥理作用的探索，D.P. Chakraborty等人發(fā)現(xiàn)千里香植物體內(nèi)含有一種新的香豆素抗生素[2]；Yao hua等人從千里香的葉子中提取了兩種氧甲基黃酮，具有抗菌消炎作用[3]；閆江紅等人利用HPLC法對千里香葉片中黃酮類成分含量進行了測定[4]。人們對該材料進行藥理分析的同時，對其組織培養(yǎng)方面以及分子蛋白水平的研究甚少，國內(nèi)外暫時還沒有千里香植物組織培養(yǎng)的相關(guān)文獻，通過本次實驗，旨在為千里香進一步的分子水平以及蛋白水平研究提供無菌材料，提高其實驗性和成功率，同時，也為植物組織培養(yǎng)技術(shù)提供新的方法和途徑。

1材料采集

于2016年8月選擇晴朗天氣在廣西省百色市境內(nèi)進行材料的采集，選擇生長健壯、污染較少、無病害的千里香植株，采摘帶腋芽的莖段、帶小葉柄的葉軸以及幼葉作為培養(yǎng)材料。

2方法

2.1外植w處理

將采集的實驗材料用無菌水沖洗8min。其中帶葉小柄的葉軸和帶腋芽的莖段分割成長約1cm的莖段，嫩葉邊緣全部剪掉，以便愈傷組織的生長，留下葉子的中心部分，約占原有葉子面積的一半以上。

2.2外植體消毒

將預(yù)處理好的外植體放入75%的酒精中，消毒8s，然后快速轉(zhuǎn)入10%的次氯酸鈉溶液消毒3min，然后用無菌水沖洗2次，再置于0.1%的氯化汞中消毒7min，之后用無菌水沖洗5次，將消毒后的外植體放在無菌濾紙上吸干表面水分后接種在胚芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。

2.3培養(yǎng)基配置

誘導(dǎo)芽生長培養(yǎng)基

MS+6-AB2.5mg/L+NAA0.5mg/L+13g/L瓊脂+30g/L蔗糖

增殖培養(yǎng)基

（1）MS+6-AB（1.5、2.0、2.5、3.0）mg/L+NAA0.5mg/L+13g/L瓊脂+30g/L蔗糖+活性炭0.5g/L

（2）MS+6-AB2.5mg/L+NAA0.5mg/L+13g/L瓊脂+30g/L蔗糖

（3）MS+6-AB2.5mg/L+NAA0.5mg/L+13g/L瓊脂+30g/L蔗糖+活性炭0.5g/L

（4）MS+6-AB2.5mg/L+IBA0.1mg/L+13g/L瓊脂+30g/L蔗糖+活性炭0.5g/L

2.4愈傷組織培養(yǎng)

初代外植體接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為溫度為26℃，光照16h，黑暗8h，光強為2500lx的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期觀察和記錄外植體的生長及變化。

2.5 6-BA濃度梯度試驗

將長勢一致、誘導(dǎo)良好的外植體分別轉(zhuǎn)入不同濃度的6-AB（1.5、2.0、2.5、3.0）mg/L的MS增殖培養(yǎng)基（1）中培養(yǎng)，每濃度試驗10瓶，培養(yǎng)30d。

2.6活性炭試驗

將誘導(dǎo)良好的外植體分別移至不含活性炭以及含有活性炭的增殖培養(yǎng)基中（2、3增殖培養(yǎng)基），進行抑制褐化實驗，每種培養(yǎng)基實驗10瓶，培養(yǎng)15d，觀察有無活性炭對外植體褐化影響。

2.7生長素種類試驗

挑選長勢好的材料放入含有一定濃度的IBA生長素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)（4），每種接種10瓶，周期30d，與其他生長素進行對比。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同6-BA濃度對愈傷組織的影響

6-BA為植物組織培養(yǎng)常用的細胞分裂素，可以有效促進細胞進行分裂，經(jīng)過查閱相關(guān)文獻發(fā)現(xiàn)植物在組織培養(yǎng)過程中，該生長素的使用含量差異較大，例如林茜等人對四數(shù)九里香植物組織進行培養(yǎng)過程中[5]，6-BA增長濃度為1.0mg/L。王小敏等人在兩面針的組織培養(yǎng)與快速繁殖中[6]，6--BA的增長濃度為2.0mg/L，因而本實驗利用不同的濃度梯度培養(yǎng)，最終篩選出最適宜千里香生長的6-BA濃度為2.5mg/L。由表1可知，當(dāng)外植處于不同濃度的6-BA培養(yǎng)基時，外植體均可長出愈傷組織，而當(dāng)6-BA濃度為2.5mg/L時，培養(yǎng)基的發(fā)芽率較高，當(dāng)6-BA濃度大于或者小于該濃度時，培養(yǎng)基的發(fā)芽率均明顯下降，因而，2.5mg/L6-BA濃度為最適宜培養(yǎng)千里香的濃度。

3.2 不同生長素種類對愈傷組織的影響

NAA、IBA均為植物組織培養(yǎng)常用的生長素，通過實驗對比，外植體處于不同培養(yǎng)基中發(fā)芽率略有不同，由表2可知，當(dāng)外植體處于含有生長素NAA的MS培養(yǎng)基中，發(fā)芽率優(yōu)于含生長素IBA的培養(yǎng)基，分析原因可能是INA促進愈傷組織生根，尤其是不定根的生長，以及外植體的生長效果等方面略低于生長素NAA。

x3.3 活性炭（AC）對愈傷組織褐化的影響

實驗發(fā)現(xiàn)，在千里香組織培養(yǎng)的各個時間段均有褐化的現(xiàn)象發(fā)生，這在一定程度上影響了千里香的生長，有實驗表明，褐化的發(fā)生及褐化程度對外植體的生長有一定的影響[7]，其中相對較大的材料褐化程度較輕，而較小的材料更容易發(fā)生褐化[8]。有報道稱，低濃度下的活性炭可以吸附培養(yǎng)基中的多酚氧化物及有毒物質(zhì)，所以可以有效地防止外植體的褐化[9]。通過比較有無活性炭發(fā)現(xiàn)，當(dāng)添加0.5mg/L的活性炭時，可以很好的抑制外植體褐化（圖1和圖2）。

3.4 溫度和光照對愈傷組織的影響

有研究發(fā)現(xiàn)，低溫條件可明顯降低褐化率，而高溫培養(yǎng)卻促進褐化的發(fā)生，當(dāng)溫度較高時褐化率達52.7%[10]。但千里香適宜在溫?zé)岢睗竦沫h(huán)境中生長，因而，選擇的組織培養(yǎng)溫度為26℃，外植體的褐化率較低，同時也符合千里香的生L環(huán)境。

培養(yǎng)光照不適亦對外植體的生長產(chǎn)生影響，趙伶俐等人研究結(jié)果表明，2000lx光強培養(yǎng)的外植體褐化率較嚴重，1000lx和3000lx光強培養(yǎng)可降低外植體的褐化率[11]，因而，本次實驗選擇2500lx光強，既可以有效降低褐化率也可以促進外植體生長。

4 結(jié)語

現(xiàn)代植物組織培養(yǎng)較常用的生長素包括6-BA、NAA、IBA，其中6-BA可促進外植體的腋芽伸長生長，NAA可促進外植體的生根，本次實驗篩選出適宜千里香外植體進行組織培養(yǎng)的生長素濃度為6-BA2.5mg/L、NAA0.5mg/L，同時，也驗證了活性炭可有效抑制外植體發(fā)生褐化反應(yīng)，增加植物體的成活率，因而較為適宜千里香組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基為MS+6-BA2.5mg/L+NAA0.5mg/L+活性炭0.5mg/L。千里香是我國的一味中草藥材，有行氣活血、解毒消腫、散瘀止痛等功效，但人們主要研究其化學(xué)組成，至今還沒有看到相關(guān)組織培養(yǎng)的文獻，通過本次實驗，篩選出千里香較為適宜的外植體生長環(huán)境，將為千里香的無土栽培和進一步的分子實驗提供材料，也為其他植物的組織培養(yǎng)提供參考。

作者簡介：徐紅紅（1988.03），女，黑龍江省鶴崗人，碩士，助教，從事千里香組織培養(yǎng)及遺傳轉(zhuǎn)化工作。Emall：

通訊作者：潘永玖，Emall：

植物組織培養(yǎng)論文:我國木蘭科植物組織培養(yǎng)研究進展

摘要：文章論述了木蘭科植物組織培養(yǎng)研究的進展，對相關(guān)工作人員工作的開展有一定借鑒意義。

關(guān)鍵詞：木蘭科；基本培養(yǎng)基；誘導(dǎo)生根

木蘭科（Magnoliaceae）植物是世界著名的觀賞園林綠化植物，有些樹種亦是我國傳統(tǒng)的中藥材。木蘭科屬種資源豐富，全世界共有15屬250種，其中我國自然分布有11屬130種，占世界總屬的37%，總種的52%，居世界各國的首位[1]。木蘭科植物在系統(tǒng)發(fā)育中是一個最古老的類群，在被子植物中受到的威脅最多，是探索被子植物起源、發(fā)展和建立被子植物自然系統(tǒng)不可缺少的材料[2，23]。隨著實際應(yīng)用的發(fā)展，木蘭科植物種質(zhì)資源越來越欠缺，有30多種已被列入我國珍惜瀕危保護植物的名單之中[16]。所以越來越多的科學(xué)工作者關(guān)注木蘭科屬種資源的保護和資源開發(fā)問題。生物技術(shù)的發(fā)展，無疑給木蘭科植物的種質(zhì)保存提供了非常好的理論基礎(chǔ)，有不少人開始利用組織培養(yǎng)技術(shù)進行木蘭科植物的種質(zhì)保存和資源開發(fā)[3-8，10-15]。但大部分尚處于初步探索階段，根據(jù)資料記載，由組織培養(yǎng)誘導(dǎo)不定芽成功的僅在二喬玉蘭（Magnolia soulangeana）[8，17]、白玉蘭（Magnolia denudata）[7，32-33]、廣玉蘭（Magnolia grandiflova）[11，17，37]、荷花玉蘭（Magnolia grandiflor L.）[22]、紫玉蘭（Magnolia liliflora Desr）[24-33]、天女木蘭（Magnolia sieboldii K.Koch）[38]、凹葉厚樸[Maganolia biloba (Rehd et Wlis)Cheng][5]、川厚樸(Magnolia officinalia Rehd et Wils)[18]、巴東木蓮(Manglietia patungensis Hu)[20]、深山含笑（Michelia maudiae Dunn.）[6]、金葉含笑（Michelia foveolara Merr.et Dandy）[17]、長蕊含笑(Michelia longistamina)[17]、闊瓣含笑(M.Platypetala Hand-Mazz.)[17]、峨眉含笑(Michelia wilsonii)[17]、醉香含笑（Michelia macclurei Dandy）[34]、火力楠（Michelia macclurei）[10，17]、樂東擬單性木蘭[Parakmeria lotungensis（Chun et C.Tsong）Law][17，21]、云南擬單性木蘭（Parakmeria yunnanensis Hu）[36]、五味子（Schisandra chinensis （Turcz.）Baill.）[19]、北五味子（Schisandra chinensis （Turcz.）Baill.）[35]、北美鵝掌楸（Liriode ndron tiliptera）[17]、鵝掌楸（Liriodendron chinense Sarg.）[12，15，17]、雜交鵝掌楸（Liriodendron Chinese×L.tulipifera ）[4，13，14，17，39]等幾十個種有報道，但經(jīng)愈傷組織或不定芽誘導(dǎo)生根的成功例子僅在鵝掌楸（Liriadeadron chinease Hemsi Sarg）[12、15]、雜交鵝掌楸（Liriodendron Chinese×L.tulipifera ）[39]、白玉蘭（Michelia alba）[7]、紫玉蘭（Magnolia liliflora Desr）[24]、云南擬單性木蘭[36]、巴東木蓮(Manglietia patungensis Hu)[3，20]、深山含笑（Michelia maudiae）[6]、醉香含笑（Michelia macclurei Dandy）[34]、五味子（Schisandra chinensis （Turcz.）Baill.）[19]、北五味子（Schisandra chinensis （Turcz.）Baill.）[35]等極少樹種中有報道，而愈傷組織內(nèi)次級代謝產(chǎn)物的研究分析未見有報道，見表1。本文就木蘭科植物組織培養(yǎng)的研究現(xiàn)狀做一綜述。

1 基本培養(yǎng)基和外植體的選擇

木蘭科植物都是木本或木質(zhì)藤本，所以在外植體的選擇上常用頂芽、腋芽、嫩莖段，而葉、葉柄、托葉等外植體在脫分化并誘導(dǎo)愈傷組織產(chǎn)生上效果并不佳。一般而言，芽誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織的能力最強，而葉柄次之，葉片低。這在鵝掌楸屬[4，12，14，17，39]、含笑屬[6，25，34]、木蘭屬[24，31]等的研究結(jié)果是一致的。在荷花玉蘭的組織培養(yǎng)[22]中發(fā)現(xiàn)，花托產(chǎn)生的愈傷組織緊密腫脹，誘導(dǎo)率較高，葉芽次之，而雄蕊、雌蕊及花被片不易產(chǎn)生愈傷組織。這一點可以啟迪我們在其他屬的外植體選擇上可以拓開思路。王碧琴對7種木蘭科植物進行組織培養(yǎng)，研究結(jié)果認為：越是幼嫩的組織部分，越易形成愈傷組織，同時，易產(chǎn)生愈傷組織的外植體，很難分化出不定芽，所以在外植體的選取上，要從實際需要出發(fā)，根據(jù)植物個體性狀，做具體選擇，對于誘導(dǎo)不定芽，苗質(zhì)組織較疏松的外植體，稍微取成熟部位并要多留莖節(jié)及生長點[17]。

合適的基本培養(yǎng)基是組織培養(yǎng)成功的一個重要因素，不同植物培養(yǎng)所要求的基本培養(yǎng)基有差異。目前植物培養(yǎng)采用的基本培養(yǎng)基主要為MS、B5、WPM、1/2MS等，每種培養(yǎng)基中鹽濃度不同，培養(yǎng)基中鹽濃度對外植體褐變和試管苗玻璃化均有影響。由表1可看出，木蘭科鵝掌楸屬植物的組織培養(yǎng)80%以上采用MS或改良的1/2MS，此外，WPM、1/2WPM、改良的Risser和White培養(yǎng)基也適合鵝掌楸的組織培養(yǎng)[12，14]。含笑屬植物的組織培養(yǎng)常采用MS[6，25，34]，生根時采用1/2MS或1/4MS。木蘭屬組培[5，7，18，22，24，31，32]中常用B5、MS培養(yǎng)基，在根的誘導(dǎo)上用1/2B5、、1/2MS或1/4MS，說明適當(dāng)降低基本培養(yǎng)基中礦質(zhì)離子的質(zhì)量濃度有利于根的產(chǎn)生和生長。

2 培養(yǎng)基配比對愈傷組織產(chǎn)生的影響

2.1 植物生長調(diào)節(jié)劑物質(zhì)

基本培養(yǎng)基提供給外植體最基本的物質(zhì)條件，使外植體生存并保持低的生理活性，而植物生長調(diào)節(jié)劑能誘導(dǎo)細胞分裂、愈傷組織生長以及根芽的分化，常用的植物生長調(diào)節(jié)劑有：生長素類和細胞分裂素類。生長素類的主要作用是啟動有絲分裂，恢復(fù)植物細胞的分裂能力，常用的有2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）、萘乙酸（NAA）、吲哚乙酸（IAA）、吲哚丁酸（IBA）等。細胞分裂素主要作用是促進細胞分裂和擴大，誘導(dǎo)芽的分化、側(cè)芽的萌發(fā)生長而抑制莖的伸長，使莖增粗，常用的細胞分裂素有激動素（KT）、6-芐基腺嘌呤（6-BA）、玉米素（ZT）、噻二唑苯基脲（TDZ）等。細胞分裂素和生長素常配合使用，使外植體生長和誘導(dǎo)效果更強。一般而言，植物生長激素通常被用來誘導(dǎo)愈傷組織形成和增殖，植物的生根多數(shù)是用生長素單獨實現(xiàn)。而愈傷組織產(chǎn)生后的增殖、分化再生植株或誘導(dǎo)細胞胚時，生長素應(yīng)相應(yīng)降低濃度或祛除，而細胞分裂素濃度適當(dāng)提高。植物組織培養(yǎng)的器官發(fā)生途徑可分為：直接器官發(fā)生途徑和間接器官發(fā)生途徑，前者是指以芽或帶芽莖段直接誘導(dǎo)不定芽然后得再生植物，后者是指外植體經(jīng)愈傷組織再誘導(dǎo)芽的再生途徑[3]。不同的器官發(fā)生途徑，在激素的選擇上有所不同。孫雁霞等[18]對川厚樸愈傷組織培養(yǎng)的研究中未用到6-BA，只用2，4-D和NAA，因其主要針對愈傷組織的增殖，所以沒有用到細胞分裂素。王琪[22]利用荷花玉蘭的花托和葉芽誘導(dǎo)愈傷組織，發(fā)現(xiàn)：2，4-D+NAA+IAA/6-BA的比值越大，愈傷組織誘導(dǎo)率越高，生長量越大。而劉賢旺等[5]對凹葉厚樸組織培養(yǎng)試驗中利用較高濃度的2，4-D（2mg/L）和較低濃度的6-BA（1mg/L）誘導(dǎo)愈傷組織的產(chǎn)生，愈傷組織的生長則適當(dāng)降低2，4-D的質(zhì)量濃度（1.0mg/L），提高6-BA的質(zhì)量濃度（1.5mg/L）。在不定芽誘導(dǎo)后的增殖中，醉香含笑[34]、五味子[19]提高生長素/細胞分裂素的比值對不定芽有明顯的增殖效果，這與劉賢旺的愈傷組織增殖所需的激素配比恰恰相反。田敏[4]對雜交鵝掌楸的研究結(jié)果表明：高質(zhì)量濃度的6-BA（2.0-4.0mg/L）能促進愈傷組織形成與不定芽的分化，蔣澤平等人[39]的研究結(jié)果與之相同，在其他因子不變的情況下，細胞分裂素所含質(zhì)量濃度愈高，啟動越快，叢生芽也較多，由此看來細胞分裂素是誘導(dǎo)外植體脫分化和直接器官發(fā)生的關(guān)鍵因子。縱觀表1的實驗結(jié)果，激素的配比是因植物種類而異的，不可一概而論，而且激素配比是組織培養(yǎng)關(guān)鍵因素，在基本原理的指導(dǎo)下，我們只有通過不斷的摸索才能篩選出的配比。木蘭科植物組織培養(yǎng)常用的激素種類有：2，4-D、NAA、6-BA等。濃度范圍分別為：2，4-D（0.1，1-3mg/L）、NAA（0.02-0.5mg/L，4mg/L）、6-BA（1-3mg/L）。王琪在荷花玉蘭組織培養(yǎng)中NAA的應(yīng)用達到4mg/L。此外IAA、KT、ZT、TDZ、BAP、IBA對木蘭科植物也是有效的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，據(jù)報道，TDZ對木本植物組織培養(yǎng)來說最有效，已經(jīng)應(yīng)用于多種木本植物組織培養(yǎng)體系的建立[39，26，27]。

2.2 非植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)

在基本培養(yǎng)基中除加入一定配比的植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)外，還常加入一些非植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，如營養(yǎng)物質(zhì)椰乳、水解乳蛋白、谷氨酰氨、蘋果汁、香蕉汁、豆芽汁等。木蘭科珍稀瀕危植物巴東木蓮在叢生芽的誘導(dǎo)時添加了10%的椰乳[3，20]，形成叢生芽苗，而未加椰乳的培養(yǎng)基中僅少數(shù)能叢生芽苗。劉賢旺比較了豆粉、水解乳蛋白、蘋果汁、香蕉汁、豆芽汁5種天然附加物對凹葉厚樸愈傷組織生長的影響，發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中添加10%豆芽汁能迅速促進愈傷組織生長。Civinova-B在研究樹木莖段培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)，加入天冬酰胺和谷氨酰胺能提高愈傷組織分化為芽的比率[44]。

3 誘導(dǎo)生根

木蘭科植物在愈傷組織誘導(dǎo)、不定芽產(chǎn)生、生根方面均較難[6，7，9]。以快速繁殖為目的的植物組織培養(yǎng)，誘導(dǎo)生根后方可用于工廠化快繁生產(chǎn)。木蘭科植物的組織培養(yǎng)只有含笑屬、木蘭屬、鵝掌楸屬等幾個屬的樹種有成功誘導(dǎo)生根的報道。陳金慧對鵝掌楸組培苗的生根及移栽技術(shù)研究結(jié)果表明：適當(dāng)降低礦質(zhì)元素的1/2MS培養(yǎng)基，附加IBA0.1mg/L生根效果較好，同時活性碳的使用可以有效提高組培苗的生根率。另外，生根能力隨所采集外植體的母本植物的年齡增加而下降。而蔡桁等對鵝掌楸組織培養(yǎng)技術(shù)研究結(jié)果表明：在生根培養(yǎng)中，以基本培養(yǎng)基WPM或1/2WPM添加NAA1.0mg/L好，而在1/2MS+IBA0.2mg/L+NAA0.1mg/L+ABT0.1mg/L組合的培養(yǎng)基的生根率為60%。在以WPM或1/2WPM為基本培養(yǎng)基進行生根培養(yǎng)時，必須采用24h光照培養(yǎng)或先暗處理7-14天再用24h光照培養(yǎng)。由此看來，在鵝掌楸的生根培養(yǎng)中，選擇合適的生長素類物質(zhì)及濃度，適當(dāng)降低基本培養(yǎng)基的礦質(zhì)元素，控制好光照是鵝掌楸試管苗生根要重點考慮的因素，此外，活性炭的使用，吸收了培養(yǎng)基中的有毒物質(zhì)，防止褐變，也能大大提高生根率。樂東擬單性木蘭在1/2MS+NAA0.3mg/L+IBA0.2mg/L的培養(yǎng)基上，添加15g/L活性炭有利于生根[21]。楮建民在白玉蘭離體培養(yǎng)和快速繁殖中用到的生根培養(yǎng)基為：1/2B5+NAA0.5mg/L+AC1.0mg/L+VB20mg/L[7]。曾宋君在對深山含笑進行快速繁殖時認為：試管內(nèi)小苗在1/2MS+NAA0.5mg/L的培養(yǎng)基上生根壯苗效果較好。周鑫對五味子組織培養(yǎng)中，生根培養(yǎng)基加入吲哚丁酸2mg/L，由此看來，適當(dāng)降低培養(yǎng)基中的礦質(zhì)濃度，添加適量的生長素類激素和活性炭有利于木蘭科植物試管苗的生根。而在巴東木蓮[20]生根誘導(dǎo)時除了以上條件的滿足外，還添加了BA0.05mg/L，但這種情況在木蘭科其他植物中不常見。

4 木蘭科植物組織培養(yǎng)中常見問題

木蘭科植物體內(nèi)含有較多的酚類化合物，由于褐變引起組織培養(yǎng)失敗，已成為快速繁殖體系建立的一大障礙。褐變產(chǎn)生的原因與植物種類、基因型、外植體部位、生理狀態(tài)、培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件等有關(guān)[42]，此外，接種中外植體大小與褐變也有關(guān)系，有報道[43]：當(dāng)莖尖小于5mm時褐變嚴重，而7-15mm較輕。對褐化現(xiàn)象的機理研究及解決的方法等有較多的文獻報道。目前普遍認為褐變的機理有兩類：非酶促褐變和酶促褐變。非酶促褐變，不涉及酶類物質(zhì)的產(chǎn)生，當(dāng)細胞適應(yīng)了脅迫環(huán)境就不在發(fā)生褐變[8]。酶促褐變是植物組織培養(yǎng)中褐變的主要因素，酶促褐變的發(fā)生必須具備3個條件，即酶、底物和氧。引起褐變的酶有多酚氧化酶（PPO）、過氧化物酶（POD）、苯丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶，引起褐變的底物主要是酚類化合物。蘇夢云對樂東擬單性木蘭莖段愈傷組織誘導(dǎo)與褐變控制的研究表明：抗氧化劑控制褐變的效果比吸附劑好，以抗壞血酸好，其次是巰乙醇和二硫蘇糖醇[21]。參照已有的控制褐變的文獻報道，對于木蘭科植物在組織培養(yǎng)中出現(xiàn)的褐變問題提出以下幾點建議：春季取外植體，外植體以頂芽好；在抗氧化劑溶液中切割、剝離外植體，盡可能減少傷口切割面積；對外植體進行低溫冷藏處理；選用專門的木本植物培養(yǎng)基如WPM，或降低基本培養(yǎng)基中的無機鹽濃度，如采用1/2MS；初期培養(yǎng)可在黑暗或弱光下進行；在培養(yǎng)基中加入適量的抗褐變劑或吸附劑，如：抗壞血酸、植酸、硫代硫酸鈉、硝酸銀、活性炭、聚乙烯吡咯烷酮等；在培養(yǎng)過程中進行細胞篩選或多次轉(zhuǎn)瓶。

5 木蘭科植物組織培養(yǎng)的前景展望

木蘭科是研究被子植物系統(tǒng)演化非常重要的科，其植物資源的多樣性是系統(tǒng)理論研究的基礎(chǔ)。此外，在實際應(yīng)用中，其許多植物在醫(yī)藥、化工、園林等方面有著廣闊的應(yīng)用前景。而木蘭科大多為木本，稀藤本，分布區(qū)域狹窄，采種困難，扦插嫁接成活率不高，資源保護和開發(fā)比草本植物難度要大。利用組織和細胞培養(yǎng)技術(shù)可以對木蘭科植物進行快速繁殖、藥物生產(chǎn)、新品種開發(fā)等。如鵝掌楸、白玉蘭等植物已建立了較好的快繁體系，但大多數(shù)木蘭科植物還在摸索階段。姜長陽利用γ射線結(jié)合組織培養(yǎng)，選育出了一年開兩次花，生長快，抗逆性強的玉蘭新品系[30]，為園林綠化植物增添了亮麗的一色。通過組織和細胞培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物，已在人參、硬紫草上實現(xiàn)了工業(yè)化。西洋參、長春花、雪蓮、紅豆杉、青蒿等植物通過細胞培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物方興未艾。木蘭科植物利用組織和細胞培養(yǎng)生產(chǎn)藥物的研究起步較晚，童再康進行了厚樸組織培養(yǎng)和高產(chǎn)細胞系建立的研究，比較了不同愈傷組織內(nèi)的酚類物質(zhì)含量[30]。木蘭科植物利用組織和細胞培養(yǎng)生產(chǎn)藥物和香料等方面值得我們不斷深入研究。

作者簡介：劉葉蔓（1975-），女，湖南新化人，湖南中醫(yī)藥大學(xué)講師，研究方向：藥用植物生物技術(shù)的研究。

植物組織培養(yǎng)論文:開展植物組織培養(yǎng)校本課程的實踐探索

摘要：校本課程的實施，給學(xué)校教師帶來很大的自主性、積極性，與此同時，校本課程開發(fā)和實施的過程，也給教師也帶來一定的挑戰(zhàn)。本文以本校開展的植物組織培養(yǎng)研習(xí)課程為例，著重探討其開展過程是如何促進生物教師的專業(yè)發(fā)展的。

關(guān)鍵詞：校本課程植物的組織培養(yǎng)　生物教師的專業(yè)發(fā)展

“素質(zhì)教育”從上世紀90年代就提出了，到21世紀又提出了“教育創(chuàng)新”，這使我們的教育觀念、教學(xué)內(nèi)容、教育手段等諸多方面發(fā)生了重大變化。為適應(yīng)新課程的需要，我校投資近30萬元，改建了植物組織培養(yǎng)室，總面積雖然只有70平方米，但實驗室的儀器配置都是很先進的，可以說麻雀雖小五臟俱全，能夠達到對學(xué)生進行研究性學(xué)習(xí)的教育、教學(xué)實驗操作平臺，為學(xué)生提供了非常好的實驗基地。2005年9月植物組培室正式啟用，我校生物學(xué)科面對新課程改革的需要與時俱進，積極開展了植物的組織培養(yǎng)校本課程的探索實踐。

一、植物組織培養(yǎng)研習(xí)課程的實踐探索

植物組織培養(yǎng)是一種在細胞水平上進行的生物工程技術(shù)。它是指離體的植物器官、組織、細胞以及原生質(zhì)體，在無菌條件下利用人為設(shè)計制備的培養(yǎng)基，培養(yǎng)在人工控制的環(huán)境里，使其再生形成完整的植株、細胞或其它次生物質(zhì)的一種技術(shù)方法。近年來，植物組織培養(yǎng)作為生物工程中的一項高新技術(shù)，它有高科技、高效益、高密度的特點，在一個較小的空間，用很少的外植體培養(yǎng)出大量的植株或物質(zhì)，因而獲得很高的經(jīng)濟效益。這在生產(chǎn)實踐和科研實驗中已被廣為采用，并引起社會各界的廣泛重視。

植物的組織培養(yǎng)課程的開設(shè)能讓學(xué)生早日了解和掌握一些先進的生物技術(shù)，在學(xué)習(xí)、參與探究和解決問題的過程中，養(yǎng)成嚴謹?shù)闹螌W(xué)態(tài)度、一定的科學(xué)研究能力和素養(yǎng)。這對于提高學(xué)生的生物學(xué)素質(zhì)、形成科技志向、訓(xùn)練可持續(xù)發(fā)展能力均具有重要的現(xiàn)實意義。

二、由植物組織培養(yǎng)課程實踐所引起的認識與思考

就本質(zhì)而言，一般的校本課程開發(fā)的價值追求有三方面：學(xué)生個性的發(fā)展、教師專業(yè)的成長、學(xué)校特色的形成。這就是說，校本課程開發(fā)本身就是教師專業(yè)發(fā)展的有效途徑之一，下面就植物組織培養(yǎng)課程的開展，探討它在技能領(lǐng)域、精神領(lǐng)域、知識領(lǐng)域這三個方面是如何促進生物教師的專業(yè)發(fā)展的。

1.校本課程的開發(fā)提高了教師的課程能力和研究能力。

(1)課程能力

植物的組織培養(yǎng)技術(shù)是近幾年出現(xiàn)的研習(xí)課程，有的重點中學(xué)開展了很多年，他們有了很豐富的經(jīng)驗。而我校則是剛剛接觸此項課程，毫無經(jīng)驗可循。我們教師要自己確定課程目標、課程內(nèi)容，還要負責(zé)課程實施、課程評估，因而必然有助于提高教師的課程能力。

①制定課程目標的能力

我們主要是通過對學(xué)生需求、學(xué)校環(huán)境、自身能力等3個方面的分析來確定課程目標的。因為是剛剛開展組培課程，組培過程、儀器操作我們也都不熟悉，所以我們把目標定在初級階段，進行初步探索：

Ｉ.初步實驗動手能力，如配制培養(yǎng)基母液、滅菌、儀器使用等基本技能，培養(yǎng)實驗的基本動手能力和科學(xué)技能。

Ⅱ.初步培養(yǎng)文獻檢索的能力。

Ⅲ.初步學(xué)會設(shè)計培養(yǎng)基配方，培養(yǎng)信息綜合能力。

Ⅳ.初步培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)問題、分析問題、在一定程度上解決問題和創(chuàng)新思維能力。

Ｖ.學(xué)習(xí)與他人進行小組合作，培養(yǎng)合作交流能力。

研習(xí)課程開展的時間長了以后，會有很多經(jīng)驗，我們制定的課程目標也會相應(yīng)有所提高。

②確定課程內(nèi)容的能力

確定植物組織培養(yǎng)課程內(nèi)容或者說編制課程是一個創(chuàng)造過程，是教師對課程內(nèi)容進行選擇，并加以組織的過程。組織培養(yǎng)技術(shù)在高中生物課程中的很多章節(jié)都有所介紹，但沒有一個完整的課程介紹組織培養(yǎng)的全過程，并且在高二上學(xué)期，學(xué)生剛開始學(xué)習(xí)生物，對組織培養(yǎng)很不了解，為了讓學(xué)生初步了解組織培養(yǎng)的含義及過程，我們查閱大量資料，確定上課內(nèi)容，制作植物組織培養(yǎng)多媒體課件，并且制定了教學(xué)進度。

③實施課程的能力

課程實施包括教學(xué)、學(xué)生自學(xué)、作業(yè)等形式，但最為重要的是教學(xué)。每次上課之前，我們都要先查閱資料如“培養(yǎng)基配方”、“母液的配制方法”、“培養(yǎng)基配制程序”、“外植體消毒和接種”等等，并將這些資料打印、分發(fā)給學(xué)生。通過教學(xué)不斷地將打印的內(nèi)容傳授給學(xué)生，將靜止的書面材料轉(zhuǎn)化為具體的教學(xué)內(nèi)容，在配制培養(yǎng)基、接種等方面指導(dǎo)學(xué)生進行實踐操作，最終使它們成為學(xué)生的經(jīng)驗。另外，因為同學(xué)們從未接觸過植物組織培養(yǎng)接種的過程，只在網(wǎng)絡(luò)和圖書上見過一些照片，為了讓大家對組培有個初步地認識，我們還組織同學(xué)參觀錦繡大地的植物組織培養(yǎng)車間，現(xiàn)場學(xué)習(xí)接種過程，效果極好。這些都大大提高了我們教師實施課程的能力。

④評估課程的能力

由于組織培養(yǎng)是基于學(xué)校而開發(fā)的，對我們而言，沒有現(xiàn)存的經(jīng)驗可供參考，這就需要我們必須自己根據(jù)實際情況制定評價方案并實施評價。我們主要制定以下初步評價目標：

Ⅰ.評價學(xué)生，是否達到了預(yù)期的學(xué)習(xí)目標。

Ⅱ.評價課程，教學(xué)內(nèi)容是否符合高中學(xué)生的學(xué)習(xí)特點，對學(xué)生的學(xué)習(xí)和能力培養(yǎng)產(chǎn)生的影響。

Ⅲ.自身評價，教學(xué)中如何引導(dǎo)學(xué)生，以后應(yīng)如何編寫相應(yīng)的教材等。

(2)實驗和研究能力

應(yīng)該說，生物教師的專業(yè)水平距離生物專家還相差很遠，組織培養(yǎng)課程的開發(fā)本身是一個教師參與科研的過程，它要求我們教師承擔(dān)起研究者的任務(wù)，這對于教師研究能力的提高大有裨益。對于不同的學(xué)科，研究能力的含義是不同的，生物是一門實驗性科學(xué)，在組織培養(yǎng)的課程開發(fā)中，我們教師不僅要研究學(xué)校、學(xué)生、自己，還要研究課程目標、課程內(nèi)容、課程理論、課程開發(fā)方法等；不僅要研究問題的解決，還要研究交往、協(xié)調(diào)的方法等等。如植物組織培養(yǎng)用的Ms培養(yǎng)基，不同培養(yǎng)基所加的生長素和細胞分裂素的量是不一樣的，為了達到效果，需要老師自己不斷的摸索；培養(yǎng)基所加瓊脂的量，不同的配方也不一樣，而它又會直接影響培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)基的硬度和瓶內(nèi)濕度，這也需要我們教師自己摸索經(jīng)驗；又如外植體的切取時究竟切取哪一部分最合適，而且不同的植物適合取哪一部分的外植體，才更易分化和成活，也需要不斷地查閱資料，實際探索，然后再指導(dǎo)學(xué)生操作。

再比如：學(xué)生在課程剛開始時，對接種的操作還很陌生，動作生疏，很多細節(jié)沒有注意，結(jié)果接種的外植體大部分出現(xiàn)污染，這時我們沒有直接讓學(xué)生倒掉重做，而是坐下來認真分析失敗的原因，經(jīng)過反思，學(xué)生總結(jié)出“接種時，有說話現(xiàn)象；培養(yǎng)基瓶離開超凈臺；操作器械消毒不嚴格”是失敗的主要原因，因此會在以后做實驗時，特別注意接種的規(guī)范性。我們教師也通過此次教訓(xùn)，了解到了外植體接種過程中消毒徹底的重要性。

就是在這種不斷發(fā)現(xiàn)問題、解決問題和查閱資料的過程中，教師的實驗和研究能力逐步得到了提高。

2.校本課程的開展給教師帶來了一系列新的

觀念

校本課程是一種新的課程形態(tài)，比較注重學(xué)生本位，著眼于學(xué)生學(xué)習(xí)方式的改變，因而必然引起教學(xué)思想的變化。

組織培養(yǎng)課程是為學(xué)生開設(shè)的，我們生物教師所做的一切歸根到底是為了提高學(xué)生的生物科學(xué)素養(yǎng)，促進學(xué)生較大限度的發(fā)展。所以參與校本課程開發(fā)有利于教師形成以學(xué)生發(fā)展為本的理念，建立新的師生關(guān)系。

互聯(lián)網(wǎng)擴大了信息來源，教師不再是知識的、真理的化身。組培課程剛開始學(xué)習(xí)的時候，很多知識都是教師教給學(xué)生。隨著課程的深入，學(xué)生資料的豐富，學(xué)生在實驗的設(shè)計等方面的能力很可能超過教師，有時會把老師問倒。這就可能引發(fā)一種理念的重建：允許學(xué)生提出不同意見，甚至反對自己的意見，并想方設(shè)法使學(xué)生超過自己。

組織培養(yǎng)課程改變了學(xué)生原有的學(xué)習(xí)方式，采用的是研究性學(xué)習(xí)，這就必然會有這樣那樣的錯誤，因此教師要允許學(xué)生犯錯，但最重要的是總結(jié)經(jīng)驗，下次不再出現(xiàn)同樣的問題。如果一個學(xué)生只知唯師是從，而沒有自己的觀點，不敢也沒有向教師質(zhì)疑的習(xí)慣，那么不僅不利于學(xué)生自身能力的形成，也不利于生物教師的專業(yè)成長。

3.校本課程使教師改變了對知識本質(zhì)的看法，而且為教師知識結(jié)構(gòu)的改變提供了可能

(1)知識的本質(zhì)

生物新課程的基本理念是“面向全體學(xué)生”、“提高學(xué)生科學(xué)素養(yǎng)”、“倡導(dǎo)探索性學(xué)習(xí)”，生物教學(xué)不僅要使學(xué)生獲取一定的知識，還要使學(xué)生習(xí)得獲取知識的方法，并使每個學(xué)生在其自身水平之上得到提高、獲得發(fā)展。

同樣，我們開展的植物組織培養(yǎng)課程重視的不是現(xiàn)存的、靜態(tài)的知識，而是強調(diào)學(xué)生自身的體驗；強調(diào)學(xué)生如何獲取有用的知識；強調(diào)那些能夠幫助學(xué)生思考與探索的東西。學(xué)生通過植物組織培養(yǎng)課程確實學(xué)會了組培的一些知識，能夠進行組培的一些操作，但更重要的是學(xué)生在整個過程中體會到了科學(xué)研究的過程，養(yǎng)成了嚴謹?shù)目蒲辛?xí)慣，學(xué)會了一些分析問題、解決問題的方法。這應(yīng)該是學(xué)生參與組培課程所得到的較大收獲，也是我們老師所要達到的目的。

(2)知識結(jié)構(gòu)的改變

教師參與植物組織培養(yǎng)課程的開發(fā)，首先要具有相應(yīng)的植物組織培養(yǎng)的課程理論知識，而這些在現(xiàn)有教材只有少部分涉及，沒有現(xiàn)成的完整的內(nèi)容，需要自己從各個方面收集資料。因此為了使自己的工作更具有成效性，我們就不得不認真學(xué)習(xí)一些組培課程理論，如四中陳穎老師編著的《“克隆”與組織培養(yǎng)》一書，閱讀其中大量的組培資料以完善自己的知識結(jié)構(gòu)，以便用科學(xué)的理論指導(dǎo)自己的工作實踐。這就必然引起教師知識結(jié)構(gòu)的重組。

就知識角度而言，生物教師的知識一般可以分為三大類：一是指生物教師所具有的特定的學(xué)科知識，如我們在大學(xué)所獲得的植物學(xué)、動物學(xué)、微生物學(xué)等方面的知識；二是教師所具有的教育學(xué)和心理學(xué)知識；三是生物教師在實際的教育教學(xué)工作中(包括研究性學(xué)習(xí)、選修課等課程中)獲得的具有明顯的經(jīng)驗性的知識，是教師經(jīng)驗的累積。這種實踐性知識的獲得正是教師專業(yè)發(fā)展的重要標準，因為對一個受過高等教育的生物教師來說，前二者的知識并不是太缺乏，教師專業(yè)發(fā)展主要是指獲得更多的實踐性知識。實踐性知識的獲得主要通過教師對自身教育教學(xué)實踐的反思，而反思正好是校本課程開發(fā)所特別強調(diào)的。

植物組織培養(yǎng)課程是我校一項新興的教學(xué)實踐活動，我們沒有現(xiàn)成的經(jīng)驗可以借鑒，整個開發(fā)活動具有極大的不確定性，因而經(jīng)驗的總結(jié)和反思就有其特殊的作用。生物教師可以在反思過程中對課程開發(fā)的過程具有更多理性認識，在課程目標確定的前提下，可以反思達到這些目標的方法，爭取少走彎路，不斷提高自己的實踐性知識。

三、結(jié)束語

我校的植物組織培養(yǎng)課程剛剛起步，同那些開展了很多年的學(xué)校相比，我們做的工作還太少，實驗教學(xué)經(jīng)驗也不足。但是通過該課程的實施，我們確實感到了它促進了生物教師的專業(yè)發(fā)展，相信隨著我校組培課程的開展，我們的學(xué)生和生物老師都會在該課程中得到更大的收獲。

植物組織培養(yǎng)論文:外來入侵植物黃頂菊種子的組織培養(yǎng)

摘 要： 本實驗以黃頂菊種子作為外植體，首次對黃頂菊進行了組織培養(yǎng)。采用基本MS培養(yǎng)基，升汞消毒時間為4 min，在光照培養(yǎng)箱內(nèi)采用不同溫度下的光暗培養(yǎng)。結(jié)果表明，黃頂菊種子的組織培養(yǎng)較易成功，本實驗確定了組培適合的培養(yǎng)基、消毒時間，以及培養(yǎng)條件。

關(guān)鍵詞： 外來入侵植物 黃頂菊 種子 組織培養(yǎng)

黃頂菊［Flaveria bidentzs （L.） Kuntze］是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種外來雜草，原產(chǎn)南美洲，也叫“南美黃頂菊”，有的地方群眾也稱“野菊花”，為一年生草本植物，分類學(xué)上屬于菊科黃菊屬（Flaveria），與萬壽菊屬天人菊屬為近緣屬。2001年首次在天津南開大學(xué)發(fā)現(xiàn)，日前在河北邯鄲、邢臺、衡水、滄州、廊坊、石家莊、保定等地不同程度發(fā)生，呈現(xiàn)以河北省中南部為中心向周邊其他省市擴散趨勢。“黃頂菊”根系發(fā)達，耐鹽堿、耐瘠薄、抗逆性強，繁殖速度驚人，一株“黃頂菊”能產(chǎn)數(shù)萬至數(shù)十萬粒種子。“黃頂菊”能嚴重擠占其他植物的生存空間，有“黃頂菊”生長的地方，其他植物難以生存，一旦入侵農(nóng)田，將威脅農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)及生態(tài)環(huán)境安全［１］－［９］。

黃頂菊國內(nèi)目前的研究主要集中在生理、生態(tài)、基礎(chǔ)防除方面，還有生物活性和化學(xué)成分等少量研究。黃頂菊在生存空間上占有極強的生態(tài)位，其生物成分和化學(xué)成分具有抗菌、殺蟲活性；另外對一些植物的發(fā)芽率及胚根的伸長有抑制作用，還對個別植物的胚根生長起到促進作用。從黃頂菊本身的生態(tài)特性及其提取物質(zhì)的角度考慮，能否利用其體內(nèi)的微生物，以及一些自身攜帶的物質(zhì)來對某種生產(chǎn)上嚴重的病害進行防治實驗研究，從而達到使黃頂菊變廢為寶的目的，對其加以利用。本實驗考慮到在非生長季節(jié)對黃頂菊進行更多方面的研究，避免外界環(huán)境因素對科研實驗造成影響對黃頂菊進行了室內(nèi)組織培養(yǎng)的探索。

1.材料與方法

1.1植物材料

黃頂菊種子，采自衡水湖碼頭。

1.2外植體的制備

將種子從植株上用雙手輕輕地揉搓下來，去掉摻雜在其中的帶有外表皮的種子，只將純凈的種子收集起來干燥環(huán)境下放置備用。

在無菌操作臺上用75%的酒精緝浸泡30s，0.1%的升汞消毒3.5min，4min，5min，無菌水沖洗3-4次，置于無菌培養(yǎng)皿中晾干，以此作為組織培養(yǎng)的材料［１０］。

1.3培養(yǎng)基的配置

未加任何激素的基礎(chǔ)MS培養(yǎng)基。

配制步驟為：MS培養(yǎng)基母液+加3%蔗糖定容調(diào)pH值至5.8加0.8%瓊脂，加熱溶解分裝20ml封口高壓滅菌（121℃，20min）接種［１０］。

1.4接種

在無菌操作臺上將消毒好且晾干的種子，用無菌的鑷子夾入到滅菌好的MS培養(yǎng)基上。封口后放入光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每瓶接種5粒種子。

1.5培養(yǎng)

將接種的三角瓶置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)，采用29℃下12h光照培養(yǎng)，26℃下12h黑暗培養(yǎng)，培養(yǎng)期為30d。

2.結(jié)果與分析

2.1升汞處理時間對外植體的影響

培養(yǎng)結(jié)果表明，升汞的處理時間不同（表1），外植體的出苗、生長狀況和污染情況都不同。其中，處理4min的結(jié)果好，外植體污染率為0，幼苗生長較快，長勢較好。處理3.5min的外植體污染率較高，說明消毒不徹底，造成出苗率較低。處理5min的外植體出苗率很低，也無污染，說明消毒時間過長。

②出芽率=出芽外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100

2.2種苗的污染

表1統(tǒng)計的污染率為外植體處的污染率，表明50%的污染率是由于升汞消毒時間的處理不當(dāng)造成的，在25天的統(tǒng)計時，出現(xiàn)了培養(yǎng)基少量青霉等真菌的污染，推斷培養(yǎng)基、實驗器材的消毒都達到標準，不是造成污染的主要原因。所產(chǎn)生的污染主要是由于操作中偶爾出現(xiàn)的不規(guī)范操作所造成的，應(yīng)該在操作中盡量嚴格規(guī)范，避免污染。

2.3種苗生長狀況

實生苗在營養(yǎng)豐富的普通MS培養(yǎng)基上長勢較好，15天左右的苗高可達0.5cm，30天的苗高可達1.5cm左右，有些可達2cm，但幼苗大部分較細弱，本實驗在后期的組培苗培養(yǎng)中將嘗試生長激素的加入，以促進苗木的增粗增長。

3.討論

組織培養(yǎng)過程中，選擇適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基種類，激素的種類及添加量等時組培成功的關(guān)鍵。本文選擇組織培養(yǎng)用普通培養(yǎng)基MS，因為為初次對黃頂菊種子進行培養(yǎng)且考慮到激素可能對后續(xù)實驗的影響，所以本實驗沒有使用生長激素。

升汞的消毒時間是影響黃頂菊種子組培成功的關(guān)鍵。

本次實驗的造成污染的主要原因是種子消毒的不徹底，另有部分污染是由于操作過程中不規(guī)范的動作造成的。這提醒我們在組織培養(yǎng)的過程中，嚴格規(guī)范的操作程序也是影響組培苗成活及后期生長成功的關(guān)鍵因素。另外培養(yǎng)基的徹底滅菌和操作器皿的嚴格消毒也是不容忽視的因素［１１］。

由本實驗結(jié)果可知，黃頂菊種子的組織培養(yǎng)是比較容易成功的，這為我們在黃頂菊的非生長期內(nèi)進行科學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。

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植物組織培養(yǎng)論文:植物組織培養(yǎng)中常見問題與對策

摘要：從植物組織培養(yǎng)中常見的污染、褐化、玻璃化現(xiàn)象等問題入手，分析了其形成的原因，并結(jié)合自身工作經(jīng)驗提出針對性的解決策略，對植物的組織快繁和工廠化育苗具有一定的參考意義和借鑒價值。

關(guān)鍵詞：組織培養(yǎng)；污染；褐化；黃化

1 污染問題及對策

1.1 污染原因分析

控制污染是組培過程中的首要技術(shù)。造成污染的原因很多，如外植體的種類、取材的季節(jié)、時間、預(yù)處理方法、消毒藥劑的種類、濃度、消毒時間以及消毒方法、培養(yǎng)基和器皿滅菌、操作人員、工作環(huán)境的要求、超凈工作臺的工作質(zhì)量等都與污染密切相關(guān)。一般來說，組培污染源分為3大類：材料帶菌、接種污染、培養(yǎng)過程感染。

1.2 對策

選擇合理的外植體種類、取材的季節(jié)、時間、初代接種選取大小適宜的外植體。在組培中應(yīng)選取帶菌較少或不帶菌體的材料作為外植體。對母株預(yù)處理，改善植株栽培環(huán)境，對母株噴布殺菌劑或抗生素。改變滅菌方法，使用真空減壓滅菌、多次消毒滅菌、混合消毒液、灼燒等。在培養(yǎng)基中加入其它抑菌劑。切分潛在的帶菌材料時，要保障所用的接種工具已經(jīng)過徹底的消毒；繼代培養(yǎng)時確保污染的材料應(yīng)給予丟棄。針對接種污染，要做到紫外燈接種室消毒，清洗超凈工作臺；接種工具、材料不要與酒精燈、超凈工作臺鐵網(wǎng)面、臺面接觸；接種人員接種時用酒精棉擦手或用濃度為75 %的酒精噴灑雙手，接種時應(yīng)穿上無菌的白大衣，戴上帽子和口罩；無菌室要注重平時除濕和熏蒸消毒工作。培養(yǎng)過程中要定期對培養(yǎng)室進行消毒處理，及時清除污染材料，污染的材料及儀器必須經(jīng)過藥液消毒后方可使用。

2 褐化問題及控制措施

2.1 褐化概念及原因分析

褐化是指在植物組織培養(yǎng)過程中，外植體在誘導(dǎo)脫分化或再分化時，自身組織由其表面向培養(yǎng)基釋放褐色物質(zhì)，以致培養(yǎng)基逐漸變成褐色，外植體也隨之進一步變褐而死亡的現(xiàn)象。褐化一般分為2種：由于細胞受脅迫或其它不利條件影響所造成的細胞死亡而形成的褐化現(xiàn)象；由于酚類物質(zhì)被多酚氧化酶氧化所引起的褐化。影響褐化的因素一般與基因型、外植體情況、培養(yǎng)條件、培養(yǎng)基有關(guān)。如溫度對褐化影響很大，高溫能使 多酚氧化酶的活性提高，促進酚類氧化；而低溫可以抑制酚類化合物的合成，降低多酚氧化酶活性，減少酚類氧化，從而減輕褐化。

2.2 控制措施

多選擇幼齡植株取材，使外植體處于旺盛的生長狀態(tài)，可大大減輕褐變。在植株的一定部位取材，使材料中酚類物質(zhì)含量較低，也有助于減少褐化。對母株進行遮光處理，不僅利于初代培養(yǎng)物的萌發(fā)，還可減輕褐化程度。利用硫代硫酸鈉、植酸、抗壞血酸等抗氧化劑、活性炭等吸附劑能夠阻止多酚氧化物對酚類物質(zhì)的氧化作用，可減少或減輕褐變。實驗證明，瓊脂量的減少、較低的pH值也有利于減少褐變。選取適宜的培養(yǎng)條件如適度的低溫、初培暗光或弱光培養(yǎng)可抑制酚類的氧化，采用45℃以上的短時間高溫處理也能使多酚氧化酶失去活性，達到抗褐變的目的。

3 玻璃化現(xiàn)象及解決途徑

3.1 “玻璃化現(xiàn)象”內(nèi)涵及發(fā)生原因

玻璃化現(xiàn)象是指在培養(yǎng)過程中材料呈半透明狀，組織結(jié)構(gòu)發(fā)育畸形的現(xiàn)象。玻璃化的苗因組織畸形，分化能力降低，移栽后也很難成活，所以不宜用作繼代和移栽的材料。它已成為組培工作的一大難題，目前其根本原因尚無定論。根據(jù)吳若菁等[1]對香石竹的組培研究得知，影響組培苗玻璃化的原因主要與激素的種類、濃度、瓊脂的濃度、外植體的取材部位、不適宜的培養(yǎng)條件有關(guān)。

3.2 解決途徑

可從以下幾個方面降低或防止玻璃化現(xiàn)象的發(fā)生。①利用固體培養(yǎng)，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的 pH值，提高瓊脂濃度，降低培養(yǎng)基的襯質(zhì)勢，造成細胞吸水阻遏，可降低玻璃化；②適當(dāng)提高培養(yǎng)基中蔗糖含量或加入滲透劑，提高培養(yǎng)基的碳氮比，降低 NH4+濃度，降低培養(yǎng)基中的滲透勢，減少培養(yǎng)基中植物材料可獲得的水分；③降低培養(yǎng)器內(nèi)部環(huán)境的相對濕度，保持適宜溫度，改善氧氣供應(yīng)狀況，減少玻璃化苗的出現(xiàn)；④適當(dāng)降低培養(yǎng)基中細胞分裂素和赤霉素的濃度；⑤利用高于40℃的溫度對外植體熱擊處理可消除玻璃化；⑥增加自然光照，實驗證明，玻璃苗放于自然光下幾天后，莖、葉變紅，玻璃化現(xiàn)象可逐漸消失，這可能與自然光中的紫外線有關(guān)；⑦改善培養(yǎng)容器的通風(fēng)換氣條件，如用通氣好的封口膜封口。

4 其它問題及相關(guān)對策

如黃化現(xiàn)象和變異率高的問題。培養(yǎng)基中 Fe含量不足、培養(yǎng)環(huán)境通氣不良、培養(yǎng)溫度不適、激素配比不當(dāng)、糖用量不足、光照不足等都會造成黃化現(xiàn)象。只有找出問題的根源對癥下藥才能從根本上解決問題。關(guān)于變異率高的問題，不僅不利于保存資源和培育優(yōu)良的品種，還會嚴重影響工業(yè)化生產(chǎn)的組培苗的質(zhì)量，必須從原始材料、培養(yǎng)基配方、增殖代數(shù)、愈傷組織等方面嚴控變異率的發(fā)生。

植物組織培養(yǎng)論文:植物組織培養(yǎng)及其在果樹上的應(yīng)用

摘要植物組織培養(yǎng)是指利用細胞全能性培養(yǎng)再生植株的技術(shù)，由于其具有快速繁殖、產(chǎn)生脫毒苗、培育新品種、克服雜交不親和障礙和保存種質(zhì)資源等應(yīng)用優(yōu)點，在果樹應(yīng)用上有重要的價值。通過介紹植物組織培養(yǎng)在果樹上的應(yīng)用，以為今后研究提供參考。

關(guān)鍵詞組織培養(yǎng)；果樹；應(yīng)用

植物的組織培養(yǎng)是利用無性生殖原理，使植物組織在人工控制的條件下，通過細胞的增殖和分化，快速發(fā)育成新植株，是近幾十年來發(fā)展的新技術(shù)。利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)在培育植物新品種和改良種性方面具有巨大的潛力，細胞融合可打破種屬間的界限，克服遠緣雜交不親和性障礙，不僅可以生產(chǎn)大量的優(yōu)良無性系，保留植株的優(yōu)異性狀，并可獲得藥用價值高和工業(yè)生產(chǎn)所需的次生產(chǎn)品；組織培養(yǎng)的植物細胞也成為在細胞水平上分析研究的理想材料。應(yīng)用植物組織培養(yǎng)技術(shù)分離單倍體細胞，能選擇突變體，提高植物的品質(zhì)，增強抗鹽、抗旱、抗寒等方面的能力，擴大植物的生長范圍；培育純合的二倍體優(yōu)良品系，縮短育種時間；通過低溫冷藏體細胞，建立優(yōu)良的基因庫，由此保存物種和種質(zhì)資源。該文主要介紹植物組織培養(yǎng)在果樹上的應(yīng)用，并提出今后的研究方向，可為今后的研究提供參考。

1植物組織培養(yǎng)概述

植物組織培養(yǎng)是指利用細胞全能性培養(yǎng)再生植株的技術(shù)，具有培養(yǎng)條件可人為控制、生長周期短而繁殖率高、管理方便等特點，其步驟可分為培養(yǎng)基配制、滅菌、接種、培養(yǎng)、馴化移植。在培養(yǎng)時可能會出現(xiàn)褐變、材料玻璃化等現(xiàn)象。

近年來，隨著科學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，植物組織培養(yǎng)技術(shù)已進入生產(chǎn)應(yīng)用階段，廣泛用于科研和生產(chǎn)，近期應(yīng)用的技術(shù)有快述繁殖、體細胞胚的發(fā)生、脫毒、胚培養(yǎng)、單倍體育種、種質(zhì)貯存與運輸以及細胞代謝物的生產(chǎn)等，而體細胞無性系變異、通過原生質(zhì)體融合進行基因轉(zhuǎn)化、通過農(nóng)桿菌或其他手段向植物導(dǎo)入基因等又是很有發(fā)展趨勢的新技術(shù)。

2植物組織培養(yǎng)在果樹上的應(yīng)用

20世紀60―80年代，在林業(yè)、農(nóng)業(yè)、園藝等學(xué)科領(lǐng)域已廣泛應(yīng)用植物組織培養(yǎng)技術(shù)，許多花卉、林木、果樹、蔬菜都可通過組織培養(yǎng)進行大規(guī)模離體快繁，試管苗已在國際市場形成產(chǎn)業(yè)化。國內(nèi)外學(xué)者先后開始果樹組織培養(yǎng)技術(shù)的研究，目前已有很多關(guān)于果樹組織培養(yǎng)的研究報道。

2.1植物組織培養(yǎng)在蘋果上的應(yīng)用

蘋果是我國重要的果樹栽培樹種，但單產(chǎn)低，品質(zhì)差，嚴重影響蘋果生產(chǎn)的發(fā)展。通過育種手段選育優(yōu)良的品種和砧木是解決存在問題的重要途徑。原生質(zhì)體培養(yǎng)及融合技術(shù)能擴大遺傳重組范圍，促進遠緣性狀的有效轉(zhuǎn)移，在應(yīng)用于育種實踐時顯示出巨大的應(yīng)用潛力。

蘋果是落葉果樹中原生質(zhì)體分離及培養(yǎng)研究比較早的樹種。Niizeki等[1]于1983年首次分離蘋果品種“Orel”的花藥愈傷組織原生質(zhì)體，經(jīng)培養(yǎng)獲得愈傷組織。費開韋等[2]于1980年在元帥蘋果花藥培養(yǎng)上獲得植株，為國內(nèi)外首次獲得大蘋果單倍體植株。截至目前，已有12個蘋果基因型的原生質(zhì)體經(jīng)培養(yǎng)再生成植株。

組織培養(yǎng)能實現(xiàn)蘋果的快速繁育，尤其對特殊種植及蘋果矮化砧木的擴繁有重要意義。高兵等[3]通過研究不同消毒方法、消毒時間、防褐化措施、激素配比對組培苗的影響，從而獲得嘎拉蘋果單芽系組培苗。徐世彥等[4]以MS為基本培養(yǎng)基，取高酸蘋果莖尖和莖段做外植體，進行離體快繁研究，挑選確定其分化、生根培養(yǎng)基的激素組成及各激素的比例關(guān)系，并且成功地進行試管苗的移栽，且移栽成活率達到93.8 %以上。紅肉蘋果[5]、蘋果矮化砧GM256[6]等其他特殊蘋果種植的組織培養(yǎng)與快繁技術(shù)也在進一步研究中。

組織培養(yǎng)可作為蘋果脫毒的重要手段，生產(chǎn)無病毒苗木。周厚成等[7]以MS為基本培養(yǎng)基，以觀賞性小蘋果“特麗”的莖段為外植體，建立小蘋果“特麗”的無菌培養(yǎng)體系。張慶田等[8]以蘋果砧木M9、M26為試材建立其各自的無菌體系。

組織培養(yǎng)是實現(xiàn)細胞工程誘變的重要手段，對蘋果新品種的獲得有重要意義。李宗偉等[9]利用組織培養(yǎng)技術(shù)獲得扎矮山定子（Malus baccata）與平邑甜茶（M.hupehensis）雜交后代的優(yōu)系93-10和93-24，提供了一種蘋果屬創(chuàng)新無融合生殖矮生砧木資源。

2.2植物組織培養(yǎng)在桃上的應(yīng)用

楊寧等[10]對扁桃砧木試管苗生長的培養(yǎng)條件進行優(yōu)化選擇，表明組合為6-BA 1.5 mg/L+IAA 0.2 mg/L+GA3 0.5 mg/L+蔗糖30 mg/L；極差分析結(jié)果表明，4個因子的重要性依次為6-BA、GA3、蔗糖、IAA。趙勝利等[11]于2008年初步建立山毛桃離體再生體系，研究結(jié)果表明：桃種子消毒方法為75%酒精（30 s）+0.1%HgCl2（5 min）+無菌水（24 h）+0.1% HgCl2（3 min）；種子去除種皮的萌發(fā)率較高；芽苗的增殖培養(yǎng)基為G+6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.2 mg/L；桃成年莖段誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg/L十NAA 0.01 mg/L。桃保存培養(yǎng)基為G+KT 0.5 mg/L+IBA 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂6 g/L。

2.3植物組織培養(yǎng)在葡萄上的應(yīng)用

培育品質(zhì)苗木是葡萄品質(zhì)生產(chǎn)發(fā)展的基礎(chǔ)和關(guān)鍵，而選擇培養(yǎng)基是建立良好的葡萄組培快繁體系和再生體系的主要工作之一，由此再進行葡萄離體培養(yǎng)。在葡萄快繁研究中，國內(nèi)外多采用MS、B5等培養(yǎng)基，同時應(yīng)用各種細胞分裂素和生長素。法國的Georges Morel首先對葡萄進行組織培養(yǎng)，提出葡萄愈傷組織培養(yǎng)所需要的適宜生長素濃度。曹孜義等于1979年在國內(nèi)首先報道葡萄試管繁殖技術(shù)，并于1980年建立我國及時個植物組織培養(yǎng)的葡萄園，而后有關(guān)葡萄莖尖快繁的研究越來越多。劉培德等[12]對貴人香、白羽等24個葡萄品種的莖尖進行再生研究，認為葡萄莖尖再生成功較易，只要是從旺盛生長的新梢上取下莖尖，接種到含有一定濃度的BA和NAA的MS培養(yǎng)基上，就能順利完成莖尖分化、芽叢形成和生根成苗。至今，葡萄莖尖離體培養(yǎng)已作為一項成熟的生物技術(shù)被運用到各個品種的研究，曹孜義等[13]于2002年研究獲得9個月繁殖2.32萬株生產(chǎn)用苗的結(jié)果，使葡萄試管苗工廠化生產(chǎn)達到更高的水平。

2.4植物組織培養(yǎng)在梨上的應(yīng)用

趙勝利等[11]于2008年初步建立鴨梨高效再生體系，研究結(jié)果表明：梨種子在離體培養(yǎng)時需去除種皮，萌發(fā)培養(yǎng)基為MS+蔗糖30 g/L+瓊脂6 g/L，發(fā)芽率為86.67%；增殖培養(yǎng)基為L2，即Ms+6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂6 g/L；生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基為G3，即1/4 MS+NAA 0.3 mg/L +蔗糖30 g/L+瓊脂6 g/L；生根數(shù)誘導(dǎo)培養(yǎng)基為1/2 MS+IBA 0.4 mg/L +蔗糖30 g/L+瓊脂6 g/L。同時該試驗還研究鴨梨試管苗離體種質(zhì)保存，結(jié)果表明：利用光照強度500 lx、添加活性炭3 g/L、大量元素減3/4、添加PP333 10～15 g/L瓊脂+水的空白培養(yǎng)基、添加甘露醇10 g/L結(jié)合30 g/L蔗糖、添加瓊脂8 g/L、添加甘露醇60 g/L、添加ABA 0.5 mg/L等方法對梨試管苗進行保存，好的已保存6個月，存活率在95%以上[11]。

2.5植物組織培養(yǎng)在核桃上的應(yīng)用

核桃是世界四大干果之一，具有很高的營養(yǎng)價值和經(jīng)濟效益，但利用無性繁殖較困難。因此，在核桃的生產(chǎn)中長期采用實生繁殖，通過扦插的核桃苗很難生根，嫁接成活率不穩(wěn)定，導(dǎo)致良莠混雜、品種退化，嚴重制約我國核桃品種化的發(fā)展。隨著組織培養(yǎng)技術(shù)的興起，從20世紀60年代末期逐步開始研究核桃組織培養(yǎng)。Driver于1984年首次培養(yǎng)出奇異核桃生根苗。在國內(nèi)，劉淑蘭等也以沙培實生苗及成年樹莖尖誘導(dǎo)出無根苗。張燕研究認為，采用80 μg/L青霉素和3 g多菌靈浸泡處理核桃外植體，控制污染的效果顯著。田愛梅研究指出，在培養(yǎng)基中加入5 mg/L抗壞血酸可有效抑制培養(yǎng)物褐化；采用誘導(dǎo)期暗培養(yǎng)、降低無機鹽濃度、添加活性炭等措施能有效地促進核桃芽苗的生根率。而張滿讓等[14]則應(yīng)用WPM培養(yǎng)基培養(yǎng)早熟油桃，其較高萌發(fā)率為95.56%。

2.6植物組織培養(yǎng)在棗上的應(yīng)用

在棗的生產(chǎn)中，傳統(tǒng)的育苗方式繁殖系數(shù)低，育苗速度慢，且浪費材料。近些年來，隨著紅棗的迅速發(fā)展，亟需大量品質(zhì)苗木，為了滿足紅棗產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展對苗木的需求，組織培養(yǎng)技術(shù)為快速育苗提供了一條新出路。

1980年，中國科學(xué)院植物研究所成功地在酸棗的組織培養(yǎng)中誘導(dǎo)大量的胚狀體，這是有關(guān)棗樹組織培養(yǎng)的最早的報道，以后此方面的工作得到廣泛的開展。其中發(fā)展最快的是利用棗樹的營養(yǎng)器官（莖段、莖尖）進行器官培養(yǎng)，建立快繁體系的研究工作[15]。

張福泉于1983年首次報道用棗莖段離體培養(yǎng)并獲得完整植株的研究。孫浩元以桐柏大棗為研究材料，以MS為基本培養(yǎng)基，對每個培養(yǎng)階段的培養(yǎng)基配方進行研究。段乃彬[15]研究認為，以棗頭莖段和根蘗莖段為外殖體，采用同樣的滅菌方式，根蘗莖段可極顯著地降低污染率。周瑞金首次建立辣椒棗離體葉片再生體系和高效的冬棗葉片再生植株快繁體系。隨著對棗組織培養(yǎng)的不斷深入研究，將會加快優(yōu)良棗樹苗木的繁殖速度，從而進一步促進棗樹規(guī)模化發(fā)展。

2.7植物組織培養(yǎng)在其他果樹上的應(yīng)用

應(yīng)用組織培養(yǎng)技術(shù)進行植物離體快繁，現(xiàn)已被世界上很多苗圃用于多種果樹繁育，除了所提到的應(yīng)用于蘋果、桃、葡萄、梨、核桃、棗外，其應(yīng)用于杏樹[16]、柿樹[17]、櫻桃[18]、柑橘[19]、李[20]等其他果樹也有相關(guān)報道。

3結(jié)語

隨著植物組織培養(yǎng)技術(shù)的迅猛發(fā)展，果樹的組織培養(yǎng)技術(shù)已由實驗室走向商業(yè)化生產(chǎn)，成為現(xiàn)代生物技術(shù)的一個重要組成部分。隨著植物基因工程研究的迅速發(fā)展，將離體培養(yǎng)技術(shù)與分子生物學(xué)方法相結(jié)合，在細胞水平上進行遺傳修飾重組DNA，可以達到改良果樹品種的目的。人們力圖通過基因工程的方法獲得抗性強、產(chǎn)量高、品質(zhì)優(yōu)良的果樹新品種，隨著植物細胞工程與基因工程的結(jié)合，更大程度地提高了基因轉(zhuǎn)化的成功率。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進步，果樹組織培養(yǎng)技術(shù)發(fā)展水平將會得到進一步的提升，在果樹生產(chǎn)中將發(fā)揮更大的作用。

植物組織培養(yǎng)論文:植物組織培養(yǎng)基中添加蔗糖的原因

高中生物的質(zhì)壁分離實驗中，用的分離劑是蔗糖溶液，能使成熟的植物細胞發(fā)生質(zhì)壁分離，但因為蔗糖不能進入植物細胞內(nèi)，故不能自動復(fù)原；而在植物組織培養(yǎng)時，培養(yǎng)基里要加入蔗糖，難道就不會發(fā)生質(zhì)壁分離嗎?那么植物組織培養(yǎng)時植物細胞如何吸收利用蔗糖?

植物組織培養(yǎng)的初期(即再分化之前)，用于培養(yǎng)的外植體(用于培養(yǎng)的離體的植物組織、器官或細胞)基本上不能進行光合作用，需要在培養(yǎng)基中添加一些碳水化合物以供植物正常生活的需要。培養(yǎng)基中的碳水化合物通常是蔗糖，蔗糖除作為培養(yǎng)基內(nèi)的碳源和能源物質(zhì)外，對維持培養(yǎng)基的滲透壓也起重要作用。

蔗糖能進入植物細胞被利用嗎?早在20世紀40年代，有人曾做過這樣的實驗：將標記的蔗糖溶液直接噴灑到葉表面，剝?nèi)ヒ恍∑~表皮或角質(zhì)層，蔗糖溶液就能進入細胞，這與外植體從培養(yǎng)基中吸收蔗糖極其相似；研究人員在葉片的韌皮部發(fā)現(xiàn)了一系列蔗糖運輸載體，包括菠菜蔗糖載體、馬鈴薯蔗糖載體StSUT1、車前草蔗糖-H+共運輸載體PmSUC2和2個擬南芥蔗糖運輸載體suc1和suc2；另有學(xué)者證明：在0.3g／mL(相當(dāng)于30％)蔗糖溶液中，植物細胞發(fā)生質(zhì)壁分離后可自動復(fù)原；另外在植物體內(nèi)的莖和葉中都能夠合成蔗糖，是光合作用的主要產(chǎn)物之一，并且可以向其他部位運輸轉(zhuǎn)移，也是植物體內(nèi)運輸?shù)闹饕问剑贿@些實驗都充分表明了植物細胞可以吸收蔗糖(而在高中一般是說蔗糖分子不能進入細胞的)。

蔗糖分子是通過次級主動運輸形式直接被植物細胞吸收。次級主動運輸是細胞利用初級主動運輸?shù)腁TP酶或質(zhì)子泵建立的質(zhì)子梯度進行的物質(zhì)運輸，并非直接利用ATP水解釋放的能量。經(jīng)科學(xué)家研究，其吸收過程大致如下：質(zhì)子泵將質(zhì)子泵出細胞，胞外形成較高的質(zhì)子濃度，建立起細胞內(nèi)外的濃度梯度，這樣，胞外的質(zhì)子順著濃度梯度趨向于向胞內(nèi)擴散。細胞膜上的特殊載體(蔗糖一質(zhì)子同向共運輸載體)除運輸質(zhì)子外，連同蔗糖一起轉(zhuǎn)運至細胞內(nèi)，這是一種蔗糖一質(zhì)子同向共運輸。

植物組織培養(yǎng)中之所以以蔗糖作為碳源，主要有三個方面的原因：首先，同樣作為碳源為植物細胞提供能量來源，蔗糖較葡萄糖能更好地調(diào)節(jié)培養(yǎng)基內(nèi)的滲透壓。配制相同質(zhì)量分數(shù)的培養(yǎng)基，蔗糖形成的滲透壓要明顯低于葡萄糖，因此若采用葡萄糖作為碳源，易使植物細胞脫水而生長不良。同時，植物細胞吸收蔗糖的速率要明顯慢于吸收葡萄糖的速率，所以蔗糖形成的滲透壓可相對長期的保持穩(wěn)定。其次，植物組織培養(yǎng)過程中，要時刻注意防止培養(yǎng)基受到微生物的污染。微生物生長所需的碳源最常用的是葡萄糖，一般很少利用蔗糖。因此，采用蔗糖作為培養(yǎng)基的碳源，可一定程度上減少微生物的污染。再次，誘導(dǎo)作用，在培養(yǎng)基成分中，增加生長素的濃度，導(dǎo)致木質(zhì)部形成，增加蔗糖濃度則導(dǎo)致韌皮部形成。當(dāng)生長素水平恒定時，2％蔗糖使分化出的全部是木質(zhì)部，4％蔗糖使分化出的幾乎全部是韌皮部，3％蔗糖則可以分化出兩者。所以，生長素和蔗糖濃度決定愈傷組織中維管束的類型與數(shù)量。因此，在植物組培中要選用蔗糖而不選用葡萄糖。

植物組織培養(yǎng)中，培養(yǎng)基中的蔗糖濃度較低的，一般為3％～10％，而質(zhì)壁分離中的蔗糖濃度為30％，可見兩者濃度差距之大，質(zhì)壁分離由于時間短，吸收速度緩慢，細胞吸收的量很少，而不是不能吸收，不足以對細胞液滲透壓造成影響，才會出現(xiàn)質(zhì)壁分離現(xiàn)象。因而只要濃度不是過高，時間又足夠長，那么蔗糖就可以進入植物細胞內(nèi)而被植物利用。同時植物體內(nèi)有蔗糖轉(zhuǎn)化酶，可以吸收和利用蔗糖，而且轉(zhuǎn)化酶在高等植物蔗糖代謝中起著關(guān)鍵的作用，研究表明，轉(zhuǎn)化酶參與植物的生長、器官建成、糖分運輸?shù)榷囗椆δ埽虼嗽谥参锱囵B(yǎng)基中加蔗糖。

植物組織培養(yǎng)論文:植物組織培養(yǎng)實驗教學(xué)創(chuàng)新體系的研究

摘要：對植物組織培養(yǎng)實驗教學(xué)創(chuàng)新體系進行了研究，通過制訂科學(xué)合理的實驗教學(xué)大綱、優(yōu)化實驗教學(xué)內(nèi)容、建立開放式實驗室及改革考核辦法，來強化實驗教學(xué)效果，提高學(xué)生的實驗素質(zhì)、科研素質(zhì)、創(chuàng)新意識和創(chuàng)新能力、集體觀念和團隊精神，提高教學(xué)質(zhì)量，培養(yǎng)學(xué)生的綜合實驗技能。

關(guān)鍵詞：植物組織培養(yǎng)；實驗教學(xué)；綜合技能

植物組織培養(yǎng)開創(chuàng)于植物生理學(xué)家Gottlied Haberland的細胞培養(yǎng)實驗，隨后各國學(xué)者經(jīng)過半個多世紀的努力，終于觀察到胡蘿卜懸浮培養(yǎng)細胞的體細胞胚胎發(fā)生（Steward等，1958），并獲得黏毛煙草（Nicotiana glutinosa）和普通煙草雜種來源的單細胞再生植株（Vasil和Hildebrandt，1965），這些研究不但科學(xué)地論證了Haberland的細胞全能性理論，而且逐步完善了植物組織培養(yǎng)技術(shù)。在近半個世紀中，植物組織培養(yǎng)應(yīng)用研究的各個領(lǐng)域得到突飛猛進的發(fā)展，推動了植物組織培養(yǎng)在植物育種、苗木快速繁殖和有用次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)等方面的應(yīng)用。同時，植物組織培養(yǎng)又是植物基因工程和植物分子生物學(xué)研究的重要基礎(chǔ)之一。沒有植物組織培養(yǎng)技術(shù)，很難想象轉(zhuǎn)基因植物等許多研究能到如此迅速的發(fā)展。由此可見，植物組織培養(yǎng)來源于實驗科學(xué)，它是一門實驗性、實踐性很強的技術(shù)類課程，要求學(xué)生具有很強的實驗動手能力，因此，植物組織培養(yǎng)的實驗教學(xué)是這門課程教學(xué)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。張紅探討了植物組織培養(yǎng)實驗教學(xué)大綱的制訂、強化技能訓(xùn)練、改革考核辦法；陳剛，冷春玲強調(diào)了開放式植物組織培養(yǎng)實驗室有利于開拓學(xué)生的創(chuàng)新能力及實驗技能的提高；姚曉惠，徐凌飛提出增加綜合性實驗，優(yōu)化實驗教學(xué)內(nèi)容，改進教學(xué)過程，成立興趣小組等有關(guān)植物組織培養(yǎng)課程的實踐教學(xué)方法。梁稱福等就植物組織培養(yǎng)課程教學(xué)方法進行了探討，從不同角度進行了植物組織培養(yǎng)理論教學(xué)的研究，探討了植物組織培養(yǎng)課程特色、教學(xué)與創(chuàng)新教育的實踐及課程教學(xué)方法。宋江華，張延紅等分別探討了園藝植物、藥用植物、園林植物等組織培養(yǎng)學(xué)課程教學(xué)過程中教學(xué)改革的思考與探索。盡管有關(guān)植物組織培養(yǎng)的理論教學(xué)及實驗教學(xué)開展了一些研究，但是，缺乏系統(tǒng)性和可操作性研究。隨著生物技術(shù)在科研與生產(chǎn)實踐中廣泛的應(yīng)用，植物組織培養(yǎng)實驗技能亟待加強，植物組織培養(yǎng)的實踐教學(xué)需要不斷完善，培養(yǎng)適合生物技術(shù)在科研與生產(chǎn)上急需的人才。針對以上需求及我們多年從事植物組織培養(yǎng)的教學(xué)與科研工作的經(jīng)驗，來開展植物組織培養(yǎng)課程實驗教學(xué)創(chuàng)新體系的構(gòu)成和實踐研究，以滿足社會對這類人才的需求。

一、調(diào)整完善植物組織培養(yǎng)的實驗教學(xué)大綱

教學(xué)大綱是根據(jù)學(xué)科內(nèi)容及其體系和教學(xué)計劃的要求編寫的教學(xué)性指導(dǎo)文件，科學(xué)合理的實驗大綱是提高教學(xué)效果的重要保障。植物組織培養(yǎng)實驗教學(xué)既要注重學(xué)生基本實驗技能的訓(xùn)練，又要培養(yǎng)學(xué)生獨立思考和解決問題的能力。所以，根據(jù)植物組織培養(yǎng)課程的特點及目前學(xué)科發(fā)展的需要可以看出，調(diào)整優(yōu)化實驗教學(xué)大綱勢在必行（見表1）。植物組織培養(yǎng)作為生物類專業(yè)（林學(xué)、花卉、園林、園藝及蠶桑等）的專業(yè)課，其學(xué)時一般為36學(xué)時，其中理論學(xué)時為27學(xué)時，實驗學(xué)時僅為9學(xué)時，植物組織培養(yǎng)的實驗耗時較長，一般需要3學(xué)時，9學(xué)時僅能開3個基本實驗，設(shè)計型、綜合型的實驗根本沒有條件開，這樣極大地限制了學(xué)生學(xué)習(xí)植物組織培養(yǎng)的熱情，同時很難使學(xué)生真正而系統(tǒng)地掌握植物組織培養(yǎng)理論及實驗技能。根據(jù)學(xué)科的發(fā)展及課程理論及實驗的要求，認為該課程學(xué)時設(shè)定為2.5學(xué)分較為合適（即45學(xué)時），其中理論學(xué)時為36，實驗學(xué)時為18，理論上11章，實驗開設(shè)6個。

二、優(yōu)化實驗教學(xué)內(nèi)容，增加綜合性、設(shè)計型實驗

將實驗內(nèi)容分為3個模塊，即基本技能（也稱為驗證性）模塊、單項技能（設(shè)計型）模塊、綜合技能（綜合型）模塊，統(tǒng)籌兼顧了植物組織培養(yǎng)各個環(huán)節(jié)技能的培養(yǎng)。除基本技能項目外，單項技能與綜合技能項目都是在教師明確實驗?zāi)康募白⒁馐马椇螅蓪W(xué)生自選材料、自主確定實驗環(huán)節(jié)（初代培養(yǎng)還是繼代培養(yǎng)）、自主設(shè)計培養(yǎng)基配方，并優(yōu)化組培成本核算，以項目教學(xué)法的形式開展實驗活動。設(shè)計性、綜合性和創(chuàng)新性實驗達到80%以上。

三、建立開放式實驗室，提高學(xué)生的綜合技能

建立開放實驗室最突出的特點是，學(xué)生選擇自己感興趣的實驗而且有了自己可以支配的時間，從而調(diào)動學(xué)生的積極性，讓學(xué)生自己設(shè)計自己感興趣的實驗或是有一定難度但是可以自行解決的實驗，依據(jù)其操作步驟進行實地操作，提高其解決科學(xué)問題的能力，在實踐中收到了良好的效果。

1.實驗素質(zhì)的提高。開放式實驗室的建立首先是注重學(xué)生實驗素質(zhì)的提高。實驗素質(zhì)是指學(xué)生進入實驗室的基本素養(yǎng)，具備良好的實驗素質(zhì)是有效實施開放式實驗室的前提。

2.科研素質(zhì)的提高。在開放式實驗室，學(xué)生們先后參與了教師的科研項目“地被植物歐石楠優(yōu)良品種的引進及繁育技術(shù)”、“紅掌優(yōu)良品種的快速繁殖及新品種選育”等項目的研究。通過參與實驗、通過現(xiàn)象觀察、數(shù)據(jù)的調(diào)查，在發(fā)現(xiàn)問題、解決問題過程中學(xué)會了查閱相關(guān)文獻資料，并采取自己掌握的科學(xué)方法認真總結(jié)歸納實驗結(jié)果等，提高了學(xué)生的科技水平素質(zhì)，提高了其就業(yè)競爭力及實踐動手能力。在走入工作崗位后，有多名學(xué)生從事植物組織培養(yǎng)等相關(guān)技術(shù)工作，并有部分同學(xué)在就業(yè)單位擔(dān)任技術(shù)骨干。還有些同學(xué)考取了研究生，從事分子生物學(xué)方面的工作，由于有植物組織培養(yǎng)技術(shù)方面的訓(xùn)練，實驗?zāi)軌蚝芸焐鲜郑艿街笇?dǎo)教師及其學(xué)長的肯定，對其迅速的生長具有重要的推動作用。學(xué)生通過親自參加科研活動，掌握了科學(xué)研究的基本方法，開拓了科研思路。現(xiàn)今組培企業(yè)的發(fā)展需要大量的技術(shù)管理人員和研發(fā)人員，為學(xué)生的創(chuàng)業(yè)和就業(yè)提供了大量機會，我院每年都有部分學(xué)生被組培企業(yè)所吸收。

3.創(chuàng)新意識和創(chuàng)新能力的提高。結(jié)合學(xué)校大學(xué)生科技創(chuàng)新項目及泰安市科技創(chuàng)新引領(lǐng)項目的研究，培養(yǎng)了學(xué)生的創(chuàng)新意識，提高了學(xué)生的創(chuàng)新能力。例如，學(xué)生參加了山東農(nóng)業(yè)大學(xué)大學(xué)生研究訓(xùn)練（SRT）計劃項目“窄冠黑白楊組培快繁及再生體系的建立”、“歐石楠體細胞胚胎發(fā)育的研究”；泰安市大學(xué)生自主創(chuàng)新引領(lǐng)項目“猥實成熟種子愈傷組織誘導(dǎo)與植株再生的研究”、“歐石楠甲基化的研究”、“珍稀瀕危樹種青檀繁育技術(shù)研究與開發(fā)”、“常綠地被開花植物―歐石楠引種及繁育技術(shù)研究”等。培養(yǎng)學(xué)生的創(chuàng)新精神和實踐能力，促進學(xué)生知識、能力與素質(zhì)的發(fā)展。在大學(xué)生科技創(chuàng)新項目及泰安市科技創(chuàng)新引領(lǐng)項目的帶動下，在學(xué)生中組建實踐小組，先由小組組織并開展實踐活動，即首先掌握植物組織培養(yǎng)的基本技術(shù)及基本的操作環(huán)節(jié)，如，培養(yǎng)瓶的清洗要求，培養(yǎng)基母液的配置，固體培養(yǎng)基的配置，外植體的采集，培養(yǎng)基、接種工具及無菌水的滅菌技術(shù)。學(xué)生在興趣小組實踐中使理論學(xué)習(xí)與科技實踐都有了一個很大的飛躍，鞏固加深了對書面課堂理論知識的應(yīng)用和理解，促進了實踐技能的掌握、提高與創(chuàng)新，培養(yǎng)了學(xué)生的創(chuàng)新意識，提高了學(xué)生的創(chuàng)新能力。

4.集體觀念和團隊精神的提高。植物組織的培養(yǎng)有一個重要的特點就是持續(xù)的時間較長，比如，外植體的初代培養(yǎng)，一般的材料需要持續(xù)30天左右，在這期間會出現(xiàn)外植體的污染、褐化、玻璃化及材料的萌動、愈傷組織的形成、芽的分化等，需要給予適宜的培養(yǎng)條件及人為的操作，無誤及周期性的更換培養(yǎng)。因此，可采取在學(xué)生中成立實踐小組，利用平時的課余時間一起進行實驗項目的分工及操作，保障實驗材料適時轉(zhuǎn)接及污染材料的及時處理；利用平時的課余時間及周末休息時間和節(jié)假日，配置培養(yǎng)基、高壓滅菌、無菌接種，適時轉(zhuǎn)接，及時觀察分析，保障整個實驗的順利進行，這都需要團隊的整體配合及分工協(xié)調(diào)，在分組實踐中既培養(yǎng)了學(xué)生的協(xié)作意識和團隊精神，又鍛煉了他們吃苦耐勞和獻身科學(xué)的精神，使他們在一次次的探索實踐中不斷克服挫折、調(diào)整心態(tài)、銳意進取。

四、改革考核辦法，加大實驗教學(xué)的比重

為了使實驗成績能如實地反映出學(xué)生的客觀實際水平，改變以往僅以實驗報告作為實驗成績，采取多種考核方法相結(jié)合的形式，以提高學(xué)生的實驗技能，客觀反映學(xué)生的實際水平。采用綜合評定的方法確定學(xué)生的實驗成績，例如將實驗報告或?qū)嶒炘O(shè)計方案、實驗操作過程中的表現(xiàn)及實驗結(jié)果和集中考核三者結(jié)合起來評定。我們將組織培養(yǎng)的一些基本實驗技術(shù)作為技能考核內(nèi)容。隨著教學(xué)經(jīng)驗的積累和實驗教學(xué)條件的改善，我們相信植物組織培養(yǎng)課程的實驗教學(xué)質(zhì)量必將更上一層樓。

作者簡介：李際紅，女，山東農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院教師，博士，副教授，主要從事林木遺傳育種與生物技術(shù)的教學(xué)與科研工作。