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篇1
應用IV型膠原快速粘附法從手術切除的人包皮組織中分離表皮細胞中的快速粘附細胞，這一群細胞被認為是表皮干細胞，它具有快速粘附、緩慢生長的特點[2]。取年齡在5～25歲無泌尿系統感染患者的包皮皮片，無菌條件下去除皮下脂肪層，用含青霉素、鏈霉素的PBS反復沖洗皮片數次，修剪成大小約0.5 cm×0.5 cm的皮片，置于培養皿中，加入0.25%中性蛋白酶10 ml，4℃消化l4～16 h，吸棄上清，分離表皮和真皮層。剪碎表皮，用0.25%胰蛋白酶+0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)消化，37℃，10 min，加入含有10%胎牛血清的DMEM終止消化，反復吹吸至細胞懸浮，200目篩網研磨過濾。濾液經1 000轉/min離心10 min，棄上清，收集細胞。加入表皮干細胞培養基(每100 ml KSFM培養基加入0.05 mmol氯化鈣100 μl、HKGS添加劑1 ml)并輕柔吹打制成單細胞懸液，接種于預先鋪有Ⅳ型膠原的培養瓶中，37℃孵育15 min。倒置鏡下觀察，粘附在Ⅳ型膠原被膜上的細胞為表皮干細胞，吸出細胞懸液，用DHank’s液洗2次，加入表皮干細胞培養基，置于37℃、5% CO2培養箱中培養。2 d換液1次，顯微鏡下觀察細胞生長，2～3 d內細胞開始分裂，4～5 d后會出現許多細胞克隆或集落。培養基中鈣離子的濃度是保持人表皮干細胞既增殖又不分化的關鍵。鈣離子濃度過低，會導致所培養的人表皮干細胞生長緩慢或不生長;若鈣離子濃度過高，則加速了細胞分化。我們在實驗中篩選出適合的培養基中鈣離子濃度，可以保證有效的培養維持。在培養過程中，還要經常檢查培養箱溫度和CO2的濃度，過低或過高的溫度和CO2含量都影響人表皮干細胞的生長，容易出現細胞老化和衰退現象。為了避免各種細菌、真菌污染培養箱，每周用75%的酒精擦洗箱內的托盤、格架、箱壁。托盤始終裝有一定量的飽和濃度磷酸氫二鈉(Na2HPO4)液體，細菌既不能在其中生長，也能提供合適的濕度[3]。
2 人表皮干細胞的傳代
當原代細胞達到70%～80%融合時，需進行傳代，否則細胞會沒有足夠的生長空間，也會因為營養耗竭而影響生長[4]。用0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化培養瓶內細胞，置37℃溫育5 min，必須經常在顯微鏡下觀察細胞被消化的情況，若細胞部分漂浮起來，即可終止消化。加入2 ml終止液，用吸管反復輕輕吹打貼壁細胞，使其形成細胞懸液，按1∶2傳代。傳代細胞接種于IV型膠原預鋪的培養瓶中。
3 人表皮干細胞的凍存
細胞不用或保種時，可將細胞冷凍保存在液氮中。細胞在培養基中直接降溫冷凍，可因細胞內、外環境中的水而形成冰晶，導致細胞內發生一系列變化，如機械損傷、滲透壓改變、蛋白變性等，從而引起細胞死亡。因此，細胞培養基中要加入保護劑二甲基亞砜(DMSO)或甘油。為保持細胞最大存活率，凍存時要遵循“慢凍快融”的原則。一般用第2代人表皮干細胞培養至對數生長期時，用含胎牛血清的DMEM培養液將細胞配成5×106 /ml 的細胞懸液，1 000轉/min，離心10 min，棄去上清，加入1～2 ml 含有10%DMSO的凍存液，用吸管小心吹打，重新懸浮細胞，分裝于2 ml凍存管中，將蓋擰緊，用記號筆記好細胞名稱、細胞代數、凍存日期、操作人等。放入-70℃冰箱過夜后，再轉入液氮罐中保存。注意：用于凍存的細胞應在光鏡下觀察生長狀態良好，凍存細胞的體積不要超過凍存管體積的1/2。
4 人表皮干細胞的復蘇
從液氮中取出凍存管后，迅速投入預先準備的40～42℃水中，并不時搖動，讓細胞凍存液快速解凍1 min左右。取出凍存管，用75%酒精擦拭消毒外壁后，吸出細胞懸液，加至10 ml離心管中，補加含胎牛血清的DMEM培養液，小心吹打使細胞分散懸浮。1 000轉/min，低速離心10 min，棄去上清，加入表皮干細胞用的條件培養基適當稀釋后，轉入IV型膠原預鋪的培養瓶中，置37℃，5%CO2飽和水蒸汽培養箱中培養。復蘇后要每天觀察細胞狀態，待細胞生長至適當密度時，及時分瓶培養或實驗待用。
人表皮干細胞培養技術發展迅速，但諸如細胞在體外培養容易變形，多次傳代后細胞克隆形成率明顯下降，細胞逐漸分化難以保持原代細胞特性等問題，還有待更好地解決。
參考文獻
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篇2
壓力性尿失禁(SUI)為女性的常見病和多發病，其發病率約為1 S%-6O%，多發生于老年人，因受經濟、宗教、教育程度等因素的影響，其實際發生率比統計發病率更高。SVl的癥狀嚴重與否都不自接危及生命，但它給患者的日常上作、生活及社交活動造成一定程度的影響，甚至會嚴重影響患者的生活質量乃至家庭和睦。
1臨床資料
注射療法是將藥物、化學制劑或自體組織等注入后尿道或膀肌頸內口粘膜下，使尿道腔變窄、拉長，延長功能性尿道的長度，提高尿道阻力，起到關閉尿道內口和后尿道的作用，從而達到有效控制排尿的口的。這一治療方法對尿道內括約肌功能障礙、尿道內壓降低同時尿道、膀肌無其他病變等壓力性尿失禁患者有較好的效果。注射療法主要優點在于.以在局部浸潤麻醉下進行操作，大多數患者的手術均.IJ.以在門診進行，適用于老年及不能耐一受大手術的患者。口前注射療法的研究主要集中在選擇不同的注射材料上，理想的注射材料應該在結構上完整，無毒、無免疫原性、無變應原性，近期內不會被分解，能長時間保持其支撐作用。口前使用的材料尚難達到上述要求，因此尋找一種取材方便、生物相容性好、安全無毒、療效滿意的注射材料十分必要。
方法：無菌技術下獲取SD大鼠雙側腹股溝區脂肪墊，消化離心，長期培養的方法獲取脂肪源性間充質干細胞。倒置相差顯微鏡觀察細胞形態變化，對培養細胞進行免疫細胞化學染色，鑒定其表面分子標志。SD大鼠24只分為3組，實驗組（6只），對照組一（3只），對照組二（3只）。分別獲取自體ADSCs，實驗組進行熒光標記。然后實驗組將熒光標記的ADSCs自體移植至尿道周圍，對照組移植未并取尿道組織進行HE染色組織學分析。
2結果
原代培養顯示培養的脂肪源性間充質干細胞2d左右開始壁,10d-14d左右可達90%融合,基本上為梭形成纖維樣細胞形態,免疫細胞化學示 CD29陽性，CD34陰性。神經切斷術后10天，除模型組和對照組一各有1只大鼠死亡外，均進行尿流動力學檢測，三組手術前后ALLP分別為：對照組一為27.1±5.1和29.1±3.2cmH2O，對照二為29.5±4.9和27.4±72.3,模型組為24.8±3.8和14.7±3.0。模型組手術后ALLP明顯降低，且組織學檢查亦證明模型組大鼠尿道周圍括約肌明顯萎縮。
3討論
本實驗將熒光金標記的脂肪源性干細胞自體移植至大鼠的近端尿道周圍，行冰凍切片，組織化學染色，熒光顯微鏡下觀察.見熒光標記的細胞呈金黃色:后取組抗體免疫移植部位有較多的Desmin陽性的細胞，棕黃色，部分出現一定的方向性，未見明顯炎癥細胞浸潤，說明己有細胞在局部存活并生長，提示能成為壓力性尿失禁注射治療的一種理想的注射材料，為將來進行細胞移植治療壓力性尿失禁提供了實驗依據。
結論：①大鼠脂肪組織中含有豐富的多能干細胞。利用消化離心，長期培養的方法可獲取大量的干細胞。②移植后大鼠的ADSCs，可以在尿道周圍成活并生長分化。
參考文獻
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篇3
1選取花蕾
一般在天氣晴朗的8~10時取材,如遇陰雨天氣,為了不影響試驗進程也可取材,但一定要選取生長良好的花序,研究報道低溫有利于小孢子的胚胎發生。盡量選取主花序或生長狀態較好的花序,然后在實驗室選取大小在2.5~3.5mm的花蕾備用。不同的材料花蕾的發育時期不盡相同,可以剝蕾挑取小孢子進行鏡檢以確定發育時期,最佳時期為單核晚期至二核期。花藥為淡綠色呈透明狀。取蕾以后如果不能立刻進行小孢子的提取,應將花蕾放置于濕潤的條件下低溫保存。
2游離小孢子分離
先用75%的醫用酒精將花蕾表面滅菌30～60s,再用0.1%升汞消毒花蕾表面15min,再用無菌水沖漂洗3次,每次5min。將消毒的花蕾置于滅過菌的玻璃管中,加約2ml b5提取液,用滅菌玻璃棒將花蕾研碎,壓出花粉小孢子,通過2層槽式無菌濾紙,或45μm的尼龍網,或0.22μm孔徑的微孔濾膜過濾,把濾液倒入滅菌了的帶蓋的10ml離心管里,用滴管吸b5抽提培養液沖洗過濾器中的花粉,沖2~3次后,在10ml離心管中將花粉懸浮液稀釋;將花粉懸浮液離心,800rpm,離心5min;將離心管中的上層清液吸去,再加液體b5抽提液,并將沉淀的花粉用吸管沖散,再次懸浮離心(用封口膜封口),1 800rpm,離心5min,吸去上層清液。
3小孢子加倍培養
將沉淀的花粉用nln-16 液體培養基稀釋,稀釋不要超過10ml,因為加倍后還要在10ml的離心管中再次稀釋離心,倒入三角瓶在32℃條件下暗培養2d左右(48~72h);然后檢查是否有污染,如果沒有污染,則分皿繼續培養。
4胚誘導培養
將加倍后的nln-16花粉懸浮液倒入離心管離心,800rpm,離心5min,倒掉nln-16液體;將沉淀的花粉用nln-13培養液稀釋,稀釋后的懸浮液分裝入7.5cm培養皿,一般每皿加入懸浮液3ml左右,含花蕾1.5~2.0個/ml,小孢子密度為10~50萬個/ml,用封口膜封口;將封口的培養皿在25℃的條件下進行暗培養,10d左右開始查看是否有可見的顆粒狀胚,如果沒有則繼續培養[2]。
5胚狀體培養
當肉眼可見的小胚狀體出現時,把培養皿放在搖床上振蕩暗培養5~7d,轉速為80～100rpm。然后將魚雷形、子葉形胚狀體移植到b5固體培養基上,在25℃光暗交替條件下持續培養,誘導植株再生[3]。
6再生苗培養
培養1~2周后,見到子葉長大變綠,胚根伸長,長滿白色根毛。繼續培養后形成真葉,胚根不再伸長。當達到3～4片真葉時,再轉移到生根培養基上生根,或在附加1mg/l 6-ba的b5培養基上進行扦插繁殖,獲得完整植株。
7再生植株倍性鑒定
對再生植株進行細胞學鑒定(染色體數目)或在開花以后根據花器形態(雄蕊和花瓣形態)進行鑒定[4-7]。若是單倍體植株,需要再加倍培養成雙倍體,可以把帶有秋水仙堿溶液的脫脂棉蓋在植株的頂芽、腋芽上;或者初花期把單倍體植株從土壤中取出,洗凈根部泥土后用0.2%～0.4%秋水仙堿溶液泡1.5～8.0h,再移栽田間;或者胚狀體再生獲得的試管苗,在含10～100mg/l秋水仙堿的b5液體培養基中無菌培養4～8d,轉到無秋水仙堿的b5培養基中培養7～14d,然后移栽到土壤中[8,9]。
8參考文獻
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篇4
METHODS: The tissue of ciliary body of postnatal 10 days rat was isolated and pided into small bits， then cultivated with nonserum DMEM/F12 medium， 20μg/L bFGF， 20μg/L EGF and 1×B27 supplement at the same time， the embryonic brain derived neural stem cells (NSC) were isolated and cultivated with routine method as positive control. These two kinds of cells were identified by detection of nestin with immunofluorescence method， which was known as a marker of neural stem cells. The characteristic of differentiation of RSC was identified in the induced condition of 100mL/L FBS medium.
RESULTS: In the primary cultivation， cell spheres with high refraction were observed 48 hours after isolation and cultivation. The cell spheres enlarged and the amount increased gradually in the fourth or fifth day of cultivation. The passage of the cells occurred in the seventh day of cultivation， and the cells of the next passage can also formed the sphere shape. The marker nestin was detected both in RSC and NSC by immunofluorescence method. The RSC became adherent with the bottom of the culture dish in the induced condition with serum， and some of the cells differentiated into cells with neural cell shapes. The characteristics of the shape， proliferation and differentiation of RSC were similar with NSC.
CONCLUSION: Tissue cultivation has the characteristics of less damage and convenience， which can be used in the isolation and cultivation of RSC successfully.
視網膜干細胞(retinal stem cell， RSC)是近年來發現的成體干細胞之一。RSC在體外培養中可自我更新和增殖，亦具有多向分化的潛能，可在一定條件下誘導分化成為神經元細胞及神經膠質細胞。RSC在體外培養、分化與移植方面的研究進展為我們最終應用這些研究成果來有效的治療致盲性眼病帶來了希望，因而，成功對其進行分離，體外培養及鑒定則為進一步研究其分化機制及細胞治療、基因治療奠定基礎。圖1原代干細胞(IM×100) A:視網膜干細胞;B:神經干細胞。圖2Nestin免疫熒光染色陽性(IF×100) A:第2代視網膜干細胞;B:第2代神經干細胞。
1材料和方法
1.1材料
孕18d Wistar大鼠及出生10d鼠，由吉林大學動物中心提供。DMEM/F12培養基、胎牛血清(Gibco公司)，B27添加劑(Invitrogen公司)，胰蛋白酶、EDTA(Sigma公司)，神經巢蛋白(nestin)兔抗大鼠多克隆抗體，FITC羊抗兔抗體(武漢博士德公司)， CO2培養箱(日本SANYO公司)，倒置相差顯微鏡( Olympus)，超凈工作臺(蘇州凈化設備廠)等。
1.2方法
將出生10d的Wistar鼠斷頸處死后置于750mL/L乙醇中消毒5min，取出眼球，浸泡于DMEM/F12培養液的培養皿中。更換新的無菌器械，在解剖顯微鏡下，首先剔除眼球外組織及視神經，在角鞏膜緣后3～4mm處環形剪開眼球，仔細去除晶狀體、玻璃體及視網膜。取出睫狀體組織放入另一無菌皿內，應用微觀剪刀盡量將組織剪成碎塊，加入DMEM/F12培養液吹打均勻，移入24孔板中培養，并于孔板中加入20μg/L大鼠表皮生長因子(EGF)，20μg/L大鼠堿性成纖維生長因子(bFGF)及1×B27添加劑，于37℃，50mL/L CO2、飽和濕度條件下培養。每天以倒置顯微鏡觀察細胞形態變化和生長狀況。當細胞形成較大團體時予以傳代，首先離心收集細胞，用2.5g/L含有EDTA的胰蛋白酶500μL消化細胞約2min，以含100mL/L胎牛血清的培養液中止消化，用移液槍吹打使細胞分散，離心去上清后，應用DMEM/F12培養液洗滌1遍，按1∶2比例傳代，每3d半量換液，約7d傳代1次。應用免疫熒光法對RSC及對照組神經干細胞進行鑒定。分別應用多聚賴氨酸處理的玻片進行細胞爬片，取出玻片，以0.1mol/L PBS沖洗1次，應用40g/L多聚甲醛固定20min，以PBS沖洗5min×3次，2g/L Triton 100作用10min，0.1mol/L PBS洗4min×3次，加入血清室溫封閉20min，傾去血清，加入一抗 (1∶100)孵育過夜(4℃)， PBS洗3次，每次5min。空白對照用PBS代替一抗。加入FITC標記的羊抗兔抗體，避光室溫放置30min，0.1mol/L PBS洗3次，每次5min。中性樹脂封片，熒光顯微鏡下觀察。另取孕18d大鼠，脫頸處死后浸泡于750mL/L乙醇5min。用碘酊及750mL/L乙醇進一步消毒小鼠腹部，無菌器械剪開孕鼠腹部皮膚，取出受孕的子宮，移入呈有PBS液的培養皿中。PBS液沖洗兩遍，剪開離體的子宮，取出胚胎，應用眼科剪剪開頭骨，小心將腦組織移入另一培養皿中，應用DMEM/F12培養液沖洗，去除腦膜及血管，并應用微觀剪刀將組織剪碎，移入加有1mL 2.5g/L含有EDTA的胰蛋白酶的離心管內，置于37℃下消化15min，每5min振蕩1次。加入含有100mL/L胎牛血清的DMEM/F12培養液終止消化，離心棄上清，應用無血清DMEM/F12培養液洗滌1遍，200目篩網過濾，制成單細胞懸液，以密度為109 /L將細胞接種于6孔板中，培養條件同RSC。收集第2代RSC及神經干細胞，應用含100mL/L胎牛血清的DMEM/F12培養液誘導分化，37℃，50mL/L CO2、飽和濕度條件下培養，倒置顯微鏡下觀察其分化情況。
2結果
2.1大鼠視網膜干細胞
分離培養48h后開始在組織塊旁出現細胞團，大小不一，由數個單個細胞構成，折光性強，呈球形或者桑葚狀懸浮生長(圖1A)。培養至4～5d后，懸浮生長的細胞團數量逐漸增多、增大。原代細胞培養至6～7d細胞團數量達到高峰。傳代時去除組織塊及雜細胞，48h即可形成新的細胞團，形態與原代相似，隨傳代次數增加細胞團數目增加逐漸變緩。取第2代RSC及神經干細胞進行nestin免疫熒光染色，鏡下可見RSC呈現陽性的綠色熒光，空白對照組無熒光顯示(圖2A)。神經干細胞nestin免疫熒光染色亦顯示出陽性綠色熒光，與RSC表現相似，空白對照組無熒光顯示(圖2B)。
2.2大鼠神經干細胞
胎鼠腦組織細胞懸液培養孔內可見培養48h后多數細胞團形成，折光性強，呈球形或者桑葚狀懸浮生長(圖1B)。培養至4～5d后，懸浮生長的細胞團數量增多，出現較大的細胞團，細胞團間可見融合現象。原代細胞培養至6～7d細胞團數量達到高峰。傳代后48h形成新的與原代相似的細胞團。與RSC相比，其細胞團增殖速度較快。圖3干細胞體外誘導分化為神經樣細胞(IM×100) A:視網膜干細胞;B:神經干細胞。
2.3干細胞體外的誘導分化
取第2代RSC及神經干細胞應用含100mL/L胎牛血清的DMEM/F12培養液進行誘導分化， 3d可見大部分RSC貼壁生長，部分細胞開始長出小突起， 7～10d細胞突起逐漸增長成條狀，呈典型的神經元形態(圖3A)。第2代神經干細胞的表現與RSC相似，但其細胞形成突起更為明顯，其具有神經元外觀的細胞較RSC增多，且細胞之間連接成網狀(圖3B)。
3討論
在以往的研究中，人們發現在部分脊椎動物的視網膜邊緣，接近睫狀體上皮的結合部存在著少量的RSC。在魚和兩棲類動物中，RSC可終生不斷生長，持續產生前體細胞，在原有視網膜的周邊產生新的視網膜，并可在視網膜損傷時增殖、分化以修復更新受損細胞。此外，人們發現在鳥類視網膜周邊部的睫狀邊緣帶也存在著不斷增殖分化的RSC，但其產生新生視網膜的能力受到限制[1]。以往認為，哺乳動物中缺乏RSC，近年來的研究證實，胚胎鼠視網膜包含著在體外具有干細胞特性的祖細胞，這些細胞除可增殖并表達神經外胚層標記外，還具有多向分化潛能[2]，而且隨著研究的不斷進展，目前，研究者們已成功的從多種成年哺乳動物及人類的睫狀體區域分離、培養出RSC。這些培養的細胞具有可自我更新、增殖的能力，在一定條件下可分化成為神經細胞、光感受器細胞等某些類型的視網膜細胞[36]，而且近年來研究證明經某些特定基因修飾后視網膜細胞將向特定類型的視網膜細胞分化[79]，RSC的研究進展為視網膜發育的具體機制研究及視網膜損傷疾病治療帶來了希望。
存在于睫狀體色素上皮層的RSC由于數量少、部位隱匿，給分離、培養帶來一定的困難。目前對RSC仍沒有固定的分離培養方法，其培養條件多與腦源性神經干細胞相似，為了抑制干細胞分化常應用無血清培養基，常用的培養基為DMEM/F12(1∶1)。為保證培養細胞持續增殖、更新、保持去分化狀態，還需要有絲分裂原(常用bFGF及EGF)。而且，還可添加培養神經細胞所需的多成分復合營養物質B27或N2以促進細胞生長。目前RSC的分離培養方法主要應用機械酶消化法，即先將組織剪成小塊，再應用胰酶等酶類進行消化，最終得到單細胞懸液。但在酶消化過程中，為防止消化過程中細胞損傷，很難把獲取組織塊完全消化成單細胞，因此有時消化所獲得的目的細胞較少。我們應用眼科微觀剪刀將組織盡量剪成小塊，直接置入培養皿內并加入培養基進行培養，避免了酶消化對于細胞的損傷，而且簡化了操作步驟，減少了細胞的流失及實驗污染的機會。培養48h即可發現較小的組織塊周圍開始不斷有細胞遷移出來，而且在首次傳代時用吸管吹打就可獲得較多的單細胞，然后再用濾網過濾即可除去雜質，得到較為純凈的細胞團。本實驗證明，應用組織塊培養法從睫狀體區分離、培養出的細胞團具有自我更新及增殖的能力，且免疫熒光法證實其與腦源性神經干細胞相似，均表達神經干細胞標記物nestin，傳代后細胞的增殖潛能及nestin的表達無明顯衰減。細胞在去除生長因子且存在血清的培養條件下與腦源性神經干細胞表現相似，可誘導分化成具有神經細胞形態的細胞，體現了其在一定條件下具有分化能力。因此，我們認為，組織塊培養法適合于來源于睫狀體區視網膜神經干細胞的分離培養，可以從少量實驗標本中較為簡單、快捷的體外擴增出大量的細胞數目以進行進一步的深入研究。
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篇5
一、信息技術發展對婦幼保健院政工干部培養的影響
1.信息技術發展對政工干部素質提出了更高的要求
信息技術的發展使得信息化素質成為政工干部的基本素質之一，婦幼保健院的政工干部也不例外。信息化素質是指主體所擁有的各種信息品質，包括信息智慧、信息道德、信息意識、信息覺悟、信息潛能和信息心理等內容。信息化素質能讓政工干部跟上時展的潮流，掌握最新的信息技術，也能讓政工干部認識到信息的重要性而自覺地利用信息提高工作質量，培養政工干部終身學習意識。婦幼保健院作為醫療體系的一部分，一些醫療技術和醫療設備更新速度很快，政工干部必須具備較高的信息化素質才能捕捉到這些信息。具體來說，信息技術的發展要求婦幼保健院的政工干部全面提高自身素質，學好信息知識、掌握信息技能的同時，還要學習政工理論知識、醫療專業知識及人文社科知識等，培養政工干部的領導管理能力、溝通交流能力等。
2.信息技術發展對政工干部素質培養提供了新的條件
信息技術的發展改變了傳統的信息的載體形式，拓寬了信息傳播的渠道，極大地縮短了信息傳播所需要的時間，使個人獲得信息的成本大大降低，為政工干部的培養創造了有利的條件。首先，政工干部學習、溝通渠道更廣。婦幼保健院可以在政工干部的培養課程中使用各種計算機輔助教學方式，它使課程內容更加生動有趣，能更好地激發政工干部的學習興趣；依靠網絡教學的方式還可以讓政工干部充分利用網上豐富的信息資源，相互交流學習；此外政工干部還可以合理安排自己的學習時間，選擇自己的學習方式，培養方式更加個性化。其次，政工干部利用信息的方式發生了改變。過去婦幼保健院的政工干部獲取信息主要靠閱讀各種紙質材料，現在政工干部閱讀的載體擴展到網絡信息，從文字擴展到圖像、聲音、三維等；在表達方式上實現了從直接手寫到鍵盤輸入、掃描等，包括直接復制或者刪減其他文件；在計算方式上也不再需要人工計算，利用計算機準確又迅速減輕了政工干部數據統計分析的負擔。
3.信息技術發展對政工干部素質培養帶來的問題
首先，信息鴻溝現象比較嚴重。在婦幼保健院的政工部門中，政工干部的能力有高有低，在掌握和使用現代信息技術方面也存在較大差異，這給政工干部的信息培養課程增加了不小的難度。其次，網絡信息量過于龐大。信息技術的發展使得，各種信息都能在網絡上迅速傳播，過量的信息會使人們很難找到自己所需要的信息，造成信息利用效率的下降，其中一些有害的信息更是嚴重影響政工干部的培養工作。
二、提高婦幼保健院政工干部培養質量的對策
1.定期完善政工干部培養方案
信息技術的發展變化是日新月異的，婦幼保健院要保證政工干部的培養緊跟時代的步伐就必須根據時代的變化對培養方案和教學計劃進行全面的調整和修訂，但是不能改變的是要始終強調培養信息化素質的重要性。培養方案的完善和修改可以從以下幾方面入手：教學目標、教學內容、教學課程專題、教師師資、教學材料和教學組織形式等，要突出強調信息化素質的地位。
2.精心設計培養的專題體系
婦幼保健院政工干部培養的基本平臺就是課程專題，怎樣設計合理的課程專題也成為政工干部培養工作的難題，可以明確的是必須要依據信息技術的發展對各類政工干部知識能力素質的客觀要求來建立課程專題體系，同時也要根據不同教學對象的性質、層次和類型做出調整。要根據政工干部的培養目標確定專題的類別和課時比例，各類專題都有圍繞解決新時期思想政治教育工作來設計，專題設置和內容都要做到內容精干、素材新穎、實在管用，不僅要包括信息化知識和技術的課程，還要有其他方面的課題。
3.打造政工干部培養的環境條件保障體系
婦幼保健院可以從以下幾個方面來支持政工部門的信息化工作。首先，配置完備的教學設施設備，包括計算機及網絡、多功能教室等。其次，建設多樣的信息化教學信息資源子系統，例如數字化圖書館信息資源、課程網絡信息資源、教學管理信息資源等。
總之，為了讓信息技術的發展更好地為婦幼保健院的政工干部培養工作服務，需要站在全局的高度將信息技術理論和方法應用到培養的全過程中，需要對政工干部培養的形式、內容、方法進行深刻變革，以提高政工干部培養的效率，全面提高政工干部信息化素質培養的質量和效益。
參考文獻：
[1]周軍、夏婷婷，論信息技術發展對政工干部培養影響及其對策，中國信息界，2012（05）
篇6
細胞的懸浮培養可謂是理想的大規模細胞培養方式，懸浮培養技術是在生物反應器中，在人工條件下，高效率大規模的培養動物細胞進而應用于生物制品生產的技術，可根據細胞的貼壁能力分為微載體懸浮培養方式和全懸浮培養方式。
1. 微載體懸浮培養。MDCK 細胞是從犬腎分離出來的一種貼壁依賴性上皮細胞，且它具有典型的“失巢凋亡”現象，即一種特殊的細胞程序死亡，是由于細胞與細胞外基質或相鄰細胞脫離接觸而誘發的，也就是說依靠傳統的馴化方式或者單純的用機械攪拌使MDCK 細胞懸浮生長難度相當大。Van Wezel 創立的微載體懸浮培養系統開創了細胞體外大規模培養的先河，更為準確的說是使貼壁細胞大規模培養成為現實。微載體懸浮培養是一種先進的貼壁細胞培養技術，其原理是將對細胞無害的顆粒加入到生物反應器的培養液中，作為載體，使細胞能在微載體表面附著生長，同時加以持續攪動使微載體始終保持懸浮狀態。反應器中使用微載體是一種可以提高細胞濃度的策略，其細胞密度可達1×107 cells/ml。
采用微載體培養MDCK 細胞，結合了懸浮培養與貼壁培養的優點，包括（1）細胞貼壁表面積大大增加，培養基利用充分，細胞密度增大。（2）微載體可在攪拌停止時沉降，便于將培養基與細胞分離。（3）與方瓶貼壁培養時的代謝變化不大，正常培養基可通用等等。
但是，目前生物反應器微載體培養研究只是單批次的培養，其消化放大培養依舊是難題。且微載體培養過程中一般添加了血清，給下游純化帶來了巨大壓力。采用商業無血清培養基，會大大增加企業生產成本。因此，自主開發無血清培養基進行MDCK 細胞懸浮培養是目前的發展趨勢。
2. 無血清單細胞懸浮培養。我們知道，生物制品生產尤其是細胞培養方法生產病毒疫苗的過程十分嚴謹。細胞培養需添加血清，可是血清的加入無疑給生產后期的除雜純化等工藝帶來難度，而且，流感病毒血凝素HA 可被宿主蛋白酶裂解為成熟的HA1 和HA2，能夠介導病毒囊膜和靶細胞膜結合，病毒開始繁殖，而MDCK 細胞本身不具備裂解HA 的蛋白酶類，所以常常添加胰蛋白酶來提高病毒產量，但是，細胞培養中的血清恰好又可以中和胰蛋白酶，這種矛盾致使MDCK 無血清培養問題更亟需解決。目前，MDCK 無血清培養已經取得了很大的進展，基本思路是在基礎培養基的基礎上補加各種生物活性因子來替代血清，結合細胞生長所需成分，配制出無血清培養基， 能夠支持MDCK 細胞正常生長增殖。一般常見的營養添加因子有：胰島素，人轉鐵蛋白，氫化可的松等等，再經過對這些添加因子的添加量的優化，最終確定無血清培養基成分。
現在，已有MDCK 細胞商業用無血清培養基，它們的成功問世解決了這一大難題。通過直接法或間接法，即：原含血清培養貼壁細胞直接消化傳代換成無血清培養基培養或逐步降低血清濃度直至降到無血清培養，使MDCK 細胞適應無血清培養基，生長狀態優良且能正常增殖傳代。
完成了MDCK 無血清培養后，MDCK 單細胞懸浮培養仍在研究當中，有文獻報道，已有馴化成功的MDCK 懸浮細胞系，但就市場應用來看，是遠遠不夠成熟的。現階段，馴化MDCK 細胞在適應了無血清培養基培養的基礎上，對其進行單細胞懸浮培養馴化方法主要有以下幾種：（1）使用硅化方瓶培養：將細胞培養方瓶先用硅化劑處理，防止了細胞的貼壁，再通過調整培養基成分，使細胞增殖；（2）使用搖床或搖瓶體系，通過外力作用，防止細胞貼壁，再對細胞進行篩選，然后擴大培養。
二、 MDCK 細胞應用于流感病毒疫苗生產
采用細胞系培養流感病毒是目前最有前景的流感疫苗生產方法，市場銷售的一些貼壁細胞系如Vero 細胞，MDCK 細胞是應用于流感疫苗研究最典型的哺乳動物細胞系，經研究，這些宿主細胞產生的病毒滴度高，大部分病毒繁殖效果好。此外，研究表明，從相應的細胞培養生產的疫苗免疫應答效果和用雞胚生產的疫苗一樣好。MDCK 細胞應用于流感疫苗生產有很多優點：MDCK細胞易培養、增殖快、易放大，感染流感病毒效率高，可高效擴增流感病毒；MDCK 細胞生產的疫苗可以應用于對雞胚蛋白過敏的患者等等。在使用MDCK 貼壁細胞接流感病毒后，通常會有較高的細胞特異性產率；微載體懸浮培養的MDCK細胞，接流感病毒后，HA 滴度可以高達9log2（1∶512）；就已知實驗室用馴化出MDCK 懸浮細胞系接流感病毒，得出的TCID50 值和HA 滴度都高于貼壁細胞系。且已有疫苗廠商如Solvay 制藥公司采用無血清培養基、微載體技術制備出了MDCK細胞流感亞單位疫苗；諾華公司制備出了由MDCK 細胞培養生產的流感疫苗Optaflu。
三、展望
在過去十幾年中，用動物細胞培養制備流感疫苗生產方式已經替代了傳統的使用雞胚生產方式。動物細胞培養生產流感疫苗的特征在于其靈活性和可擴展性，然而，貼壁細胞易培養但是卻很難擴大生產量，而如果使用微載體提供生長表面又會大大增加其成本。所以要努力創建懸浮細胞系，特別是MDCK懸浮細胞系。
多年以來，監管部門督促行業設立無血清培養流程，以避免污染。
然而，許多市售培養基仍然需要添加物，以達到高細胞密度和最大產物產量。理想的情況是，在疫苗生產中應該使用不需添加另外的蛋白質等混合物的已知成分的培養基。這不僅會降低批次變化的風險也有利于病毒收獲的下游處理。此外，疫苗生產過程可以被簡化，可以直接接毒而不用更換培養基。
篇7
關鍵詞：乙醇； 肝細胞； 原代培養； 黃芩莖葉總黃酮； 保護作用
The Protective Effect of Total Flavonoid in scutellaria baicalensis Stem-Leaf on Primary Cultured Mice Hepatocytes Injured by Ethanol
Abstract：ObjectiveTo study the protective effect of total flavonoid in Scutellaria baicalensis stem-leaf (SSTF) on primary mice hepatocyes injured by ethanol. MethodsPrimary hepatocytes were isolated， cultured by trypsin digestion and induced by ethanol. Various concentrations of SSTF were added to the primary cultured hepatocytes for 12h.The content of malondialdehyde(MDA) in hepatocytes and the activity of ALT in cultural supernatant were determined by general methods，the viabilities of hepatocytes were measured by MTT.ResultsThe elevation of MDA content of hepatocytes and ALT level in supermatant of cultural hepatocyes were restored remarkably by SSTF， hepatocytes viability was improved significantly by SSTF.ConclusionSSTF has a protective action on primary mice hepatocyes injured by ethanol.This might be associated with its anti-lopoperoridation.
Key words：Ethanol; Hepatocytes; Primary cultured; SSTF; Protective effect
肝臟是酒精代謝的主要臟器，過量飲酒可造成肝臟不同程度的損害，并進一步發展為脂肪肝、肝纖維化和肝硬化，嚴重危害人類健康。了解酒精性肝損傷的發病機制，篩選有效預防和治療的藥物應用于臨床，是當前面臨的重要課題。黃芩莖葉總黃酮(SSTF)是我院中藥所對黃芩的莖葉部分提取的有效成分，整體實驗已證實其對肝損傷有保護作用［1］。本文建立體外乙醇性肝細胞損傷模型，在細胞水平上進一步研究乙醇性肝損傷的機制及SSTF對肝細胞保護作用機制。
1 材料與方法
1.1 藥品與試劑SSTF（含總黃酮73%）：承德醫學院中藥研究所提供，臨用前以蒸餾水配制，用飽和碳酸氫鈉調pH=7.6；Hanks液高壓滅菌，4℃保存；0.8 g?L-1胰蛋白酶：用Hanks液溶解，過濾除菌，調pH 7.2，分裝，-30℃保存；基礎培養液：RPMI 1 640培養基10.0 g，用超凈水900 ml溶解，5.6%NaHCO3調pH至7.2，定溶到1 000 ml，過濾除菌，臨用前每80 ml，加入新生小牛血清20 ml，青霉素100 u?ml-1，鏈霉素100 μg?ml-1，胰島素5 μg?ml-1；MTT：SIGMA公司；ALT，MDA測定試劑盒:南京建成生物工程研究所。
1.2 動物昆明種小鼠，1~3 d齡乳鼠，雌雄不限，清潔級，承德醫學院實驗動物管理中心提供。
1.3 儀器CO2培養箱（Taibai LNA-122D 日本），MD-100半自動生化分析儀（美國Bayer公司），721W微機型分光光度計（上海光學儀器五廠），離心機（TGL.16G 上海）。
1.4 肝細胞分離培養［2］取新生小鼠30只，斷頭放血，無菌分離肝臟，置Hanks液中，灌注沖洗肝臟至灰白色，將肝臟剪成1 mm3左右的組織塊，用Hanks沖洗數次，除去血細胞，加入0.8 g?L-1胰蛋白酶10 ml，37℃孵育12 min，加入數滴血清終止消化，用滴管輕吹打成細胞懸液，經200尼龍篩網過濾后用培養液洗2次，1000 r/min離心5 min，收集肝細胞，臺盼藍活細胞計數>85%，按1 ×109個?L-1，接種于鋪有鼠尾膠原的24孔和96孔板中，37℃，5%CO2條件下培養。
1.5 乙醇誘導肝細胞損傷模型的建立將含肝細胞培養液的96孔板培養24 h更換培養液，設正常對照組，25，50，75，100 mmol?L-1四個乙醇組，肝細胞懸液與不同濃度乙醇繼續培養12 h，取培養液按賴氏法測定ALT活性，TBA法檢測MDA含量，MTT法測定肝細胞存活率。
1.6 SSTF對誘導肝細胞損傷的作用取上述培養24 h肝細胞，設乙醇損傷模型組、SSTF(100，200，300 mg?L-1)3個劑量保護組、正常對照組，每組設8個復孔。模型組和SSTF組加入乙醇100 mmol?L-1，同時SSTF組加入不同濃度的SSTF，正常對照組加不含血清的培養液，繼續培養12 h，收集培養上清液檢測ALT活性和MDA含量，MTT法測定肝細胞的存活率。
1.7 統計學處理數據以±s表示，用SPSS11.5計算機軟件進行統計學分析， 組間比較采用t檢驗，P
2 結果
2.1 乙醇對原代培養肝細胞的損傷不同濃度的乙醇作用于肝細胞，對細胞有劑量依賴性的損傷作用，25 mmol?L-1作用不明顯，光鏡下細胞形態基本正常，隨著濃度的增大，肝細胞存活率呈進行性降低，反映肝細胞損傷的酶ALT逐漸升高；鏡下觀察肝細胞損傷明顯，細胞結構不清，核融解和核膜破裂，其中100 mmol?L-1乙醇作用最明顯。
表1 不同濃度乙醇對肝細胞ALT水平及細胞存活率的影響（略）
與空白對照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；n=6
2.2 SSTF對乙醇損傷肝細胞的保護作用100 mmol?L-1乙醇作用肝細胞后，肝細胞損傷明顯，大量細胞壞死，細胞內ALT釋放量明顯升高，細胞內MDA含量較對照組明顯增高；而給予SSTF保護后， ALT水平明顯降低，MDA含量亦明顯降低，肝細胞存活率明顯升高，并呈現劑量依賴性(P＜0.05或P＜0.01)。顯示：SSTF能夠保護肝細胞、穩定肝細胞膜的結構，其保護作用可能與抗脂質過氧化作用有關。
表2 SSTF對乙醇損傷肝細胞ALT，MDA水平及細胞存活率的影響（略）
與對照組比較，*P＜0.01，與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；n=6
3 討論
乙醇本身和它的氧化物乙醛對肝細胞有直接毒性作用［3］。乙醇進入機體后，在肝細胞乙醇脫氫酶、乙醛脫氫酶、細胞色素P450等作用下產生氧自由基，氧自由基除直接損傷肝細胞外，還可通過增加肝細胞對脂質過氧化的敏感性，導致細胞膜和細胞器破壞，肝酶逸出，細胞死亡［4］。ALT是肝細胞內主要酶之一，肝細胞膜損傷時，細胞內ALT釋放量增加，因此檢測培養液中ALT活性是判斷肝細胞膜損傷最明顯的標志［5］，MTT法檢測細胞存活情況可直接反映細胞損傷程度，MDA是肝細胞脂質過氧化的最終產物，其含量高低可反映膜脂質過氧化程度的強弱和肝細胞損傷的程度［6］。我們在研究中發現，低劑量酒精對肝細胞損傷不明顯，ALT水平和MDA含量變化不大，隨著酒精濃度的增加，細胞培養液中ALT呈進行性升高，細胞存活率逐漸下降，并且MDA含量也呈現進行性增加，表明過量飲酒可引起肝細胞氧化損傷。為了充分證實SSTF對酒精性肝損傷的保護作用，我們以100 mmol?L-1乙醇制備小鼠肝細胞損傷模型。結果表明，在酒精損傷的肝細胞中加入SSTF后，肝細胞損傷明顯減輕。隨著SSTF劑量增加，培養液中ALT水平逐漸降低，肝細胞存活率明顯升高，與模型組比較，差別顯著（P
參考文獻
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篇8
被譽為“試管嬰兒之父”的英國劍橋大學教授羅伯特•愛德華說：“克隆單純從技術上講非常簡單，就是把卵細胞中DNA去掉，然后將體細胞中的DNA移入其中。這在世界上任何一個試管嬰兒實驗室中都可以完成，困難在于如何降低克隆的危險。”
本文以此熱點問題作為命題材料，對2011年高考生物試題進行單項預測。預測材料及其涉及的知識、試題如下：
1．試管嬰兒
【知識鏈接】要做好有關“試管嬰兒”的試題，除了書本上的知識外，還要掌握“試管嬰兒”技術的有關知識。“試管嬰兒”技術是通過將不孕夫婦的和卵細胞取出在試管中完全受精，并在試管中培養使其發育到囊胚期，再將胚胎移入女性子宮內使其發育成胎兒。
體外受精步驟包括：的采集與培養、卵母細胞的獲取與培養、體外受精等操作技術。具體過程如下圖:
哺乳動物胚胎發育的過程大體概括如下圖：
例1 下列關于關試管嬰兒的說法，不正確的是（）
A. 從良種母牛體內采集的卵母細胞都需要進行體外培養
B. 從良種公牛采集的需進行獲能處理
C. 早期胚胎移植的意義在于提高優良母畜的繁殖率
D. 早期胚胎指的是由受精卵發育至原腸胚時期的胚
解析：本題考查了試管嬰兒的相關知識。根據體外受精和胚胎發育過程圖解可知，早期胚胎指的是由受精卵發育至囊胚時的胚。
答案：D
例2 據2008年1月17日《干細胞》雜志報道，某科學家使用了進行試管受精的年輕女性捐獻的卵子，以及2名志愿者的皮膚成纖維細胞，成功克隆出了5個人體胚胎，進而可以開發出有研究價值的干細胞。請回答：
（1）上述過程中主要應用到的兩項動物細胞工程技術為；若將某經過修飾的基因導入其中的部分胚胎干細胞，常用的方法是。
（2）在使用合成培養基進行胚胎干細胞培養時，通常需要加入等天然成分；在細胞培養時，要保證被培養的細胞處于一定的氣體環境，所需要的氣體主要有 。
（3）科學家欲進行胚胎分割移植，則應該選擇發育良好、形態正常的或囊胚，將其移入盛有操作液的培養皿中，然后用分割針進行分割。
答案：（1）動物細胞培養、細胞核移植顯微注射技術（法）
（2）血清（血清、血漿） 氧氣和二氧化碳 （3）桑葚胚
2．克隆人研究
【知識鏈接】克隆人的基本原理是動物細胞核的全能性，包括胚胎細胞核移植和體細胞核移植。其基本過程為：
細胞核移植技術中注入去核卵母細胞中的不是供體細胞核，而是整個細胞，伴隨著兩細胞融合，體現細胞膜的結構特點：具有一定的流動性。該技術形成重組細胞繼而發育成一個新個體，體現了細胞核的全能性而非動物細胞的全能性。
例3 下圖為克隆人的示意圖，據圖回答：
（1）圖中所涉及的現代生物技術有、和
等。
（2）下列有關胚胎移植的敘述正確的有（）
A.沖卵指的是從子宮中沖出胚胎，而非沖出卵子
B.只有供、受體生理環境高度一致，移入受體的胚胎才能被接受，并繼續發育
C.供體和受體要進行免疫檢查，防止發生免疫排斥反應
D.不同動物其胚胎移植的時間不同，人的胚胎移植最好在四個細胞階段進行
（3）圖中兩個嬰兒長大后，外貌、性格和其他特征與原型男人相同，這說明 具有全能性。
（4）使用培養基進行胚胎干細胞培養時，通常要加入等天然成分，除了保證被培養細胞處于無菌、無毒及充足氧氣的環境中，還需要保證細胞生活所需的；早期胚胎發育在階段以前的細胞是全能細胞。
（5）圖中從“內細胞團到胚胎干細胞”的培養過程中，必須用處理內細胞團，使之分散成單個細胞。干細胞形成組織、器官必須要進行 和 。
（6）在體外培養胚胎干細胞能否獲得動物器官?
。為什么？
解析：（1）該圖利用了細胞核移植、動物細胞培養、胚胎分割移植等技術。（2）沖卵一般是指是胚胎收集中的沖卵――胚胎、早期胚胎。供體和受體只有保證具有相同的生理狀態，才能保證胚胎的正常發育。（3）克隆過程說明動物細胞核具有全能性。（4）動物細胞培養液的成分包括葡萄糖、氨基酸、無機鹽、維生素和動物血清等。動物細胞培養的條件：無菌、無毒的環境；營養物質（合成培養基）；溫度和pH（36.5±0.5℃，7.2～7.4）；氣體環境（氧氣和二氧化碳）等。（5）動物細胞培養過程常用胰蛋白酶處理組織，以使之分散成單個細胞。（6）胚胎干細胞在體外培養條件下一般只能增殖進行細胞分裂，不能發生細胞分化。
答案：（1）核移植 胚胎移植 細胞培養（另外寫細胞融合、胚胎分割也對，寫了三個則給滿分）（2）ABD（3）動物體細胞核 （4）血清 溫度和pH 桑葚胚（5）胰蛋白酶 細胞的分裂 分化 （6）不能 胚胎干細胞在體外培養條件下可以增殖而不發生分化
3．生物技術中的倫理問題
【知識鏈接】生物技術引發的倫理問題包括克隆技術引發的倫理問題、試管嬰兒引發的倫理問題、基因檢測引發的倫理問題。中國政府對于克隆技術的態度是禁止生殖性克隆人，不反對治療性克隆人；對于試管嬰兒的態度，中國衛生部的規定是實施體外受精、胚胎移植及衍生技術必須獲得衛生部的批準證書。
例4下圖所示為人類“治療性克隆”的大致過程。請回答下列問題：
（1）圖中①為 細胞，過程A是目前實現體細胞克隆的關鍵技術，該技術稱為 。
（2）圖中③能誘導分化出神經細胞、血細胞、肌肉細胞，其根本原因是 的結果。這樣培育得到的組織器官進行自體移植的最大好處是 。
（3）若應用轉基因技術治療遺傳性糖尿病，可將健康人的控制胰島素合成的基因導入結構④中的
，原因是這些細胞 。
（4）在用PCR技術擴增胰島素基因時，緩沖溶液中必須加入的物質有：、分別與兩條模板鏈結合的兩種引物、 以及四種脫氧核苷酸。DNA的合成方向總是從子鏈的延伸。
（5）我國政府禁止生殖性克隆，但不反對治療性克隆研究。為什么要反對生殖性克隆（即克隆人）呢？請你寫出一條理由： 。
解析：從圖可以看才出，治療性克隆是將患者的體細胞的核與卵細胞的細胞質進行重組， 形成重組細胞，將重組細胞經過培養得到囊胚，取囊胚內細胞團培養得到不同組織器官，可用于進行自體移植，不會產生免疫排斥反應。
答案：（1）次級卵母（卵） 核移植
（2）基因選擇性表達不會產生排異（免疫排斥）反應
篇9
Studies on Specifity Detection of Transdifferentiation of Epidermal Stem Cell to Conjunctival Epithelium
MENG Fanjian1CHEN Jiaqi2
1.Guangzhou Red Cross Hospital，Guangzhou 510220, China；2.Zhongshan Ophthalmic Center, SUN Yat-sen University, Guangzhou 510060，China
[Abstract] Objective To detect the transdifferentiation epidermal stem cells using realtime RT-PCR, and to ensure the feasibility of stem cell treatment on ocular reconstruction. Methods The experimental group cells were co-cultured with the conjunctival epithelial cells as the feeder cells with setting the blank control group. The both groups were cultured for the same time, and after 1, 3, 5, 7 day（s） extracted the RNA and detected the expression of genes beta-2-microglobulin and keratin 13 by real-time RT-PCR method. Results Since the third day there were expression of genes beta-2-microglobulin and keratin 13 in the experimental group, and on the fifth and seventh day the expression increased significantly（P＜0.01）. Conclusion The transdifferentiation epidermal stem cells in this study possessed the same biological characteristics as the normal conjunctival epithelium.
[Key words] Epidermal stem cell; Conjunctival epithelium; Real-time RT-PCR
表皮干細胞為皮膚組織中的專能干細胞，是一種成年組織干細胞[1]，可增殖分化為表皮中各種細胞成分，保持皮膚正常的表皮結構。表皮干細胞的分化方式有兩種：對稱分裂和不對稱分裂。前者分裂成兩個和母細胞相同的子代干細胞；而后者則分裂成一個子代干細胞和一個與母細胞不同的短暫擴增細胞（TAC）[2]，TAC屬定向祖細胞。近年來干細胞療法已成為治療多種疾病的新途徑，可替代、修復、加強受損的組織或器官的功能[3]。本研究應用組織工程學技術將表皮干細胞體外定向誘導分化為結膜上皮細胞，通過對目的細胞生物特性的檢測，探討其在臨床眼表結膜重建治療中的應用前景。
1材料與方法
1.1 材料
1.1.1人皮膚材料包皮標本來自中山大學第一附屬醫院泌尿外科包皮環切術患者，無泌尿系統疾病感染，患者年齡18～30歲，所取包皮標本均得到患者知情同意。
1.1.2結膜組織取自尸體眼正常結膜組織。
1.1.3試劑和儀器PCR用Taq酶采用TaKaRa公司的Ex-Taq；熒光定量試劑盒：SYBR（R） premix Ex TaqTM（Perfect Real Time）購自TaKaRa公司（美國）；TRIZOL® Reagent RNA提取試劑盒購自Invitrogen公司（美國）；RNA提取反轉錄PCR試劑盒購自Promega公司（美國）；RoboCycler®Gradient Temperature Cycler PCR儀（Stratagene公司，美國）；MJ Research OpticonTM4熒光定量PCR儀（美國）。
1.2方法
1.2.1飼養細胞的培養取尸體眼結膜，用加有1×103U/mL青霉素不含鈣鎂的PBS緩沖液沖洗3遍，于無菌超凈臺剪除結膜下筋膜組織，將其上皮面向上平鋪于無菌培養皿中，加0.25% Dispase Ⅱ，置于37℃消化2h，棄去消化液并用無菌虹膜恢復器刮取上皮組織，并加入0.25%胰酶及0.02% EDTA消化約20min，待倒置顯微鏡下見到上皮細胞充分消化為多個單細胞狀態時加入上皮細胞培養液中止消化，收集細胞懸浮液，置于離心管內，以1500r/min離心5min，獲得消化的結膜上皮細胞，將其調整為1×104個/mL，在6孔Transwell培養板insert池中加入1mL結膜上皮細胞懸液飼養細胞組為實驗組，對照組insert池中無飼養細胞，僅為相同體積的上皮細胞培養液。
1.2.2表皮干細胞的分離、篩選、培養取無菌手術獲得的包皮皮片，用加有1×103U/mL青霉素不含鈣鎂的PBS緩沖液沖洗3遍后用含有1×103U/mL青霉素、2.5mg/L兩性霉素不含鈣鎂的PBS緩沖液浸泡30min，無菌超凈臺剪除皮下組織，并剪成2mm×4mm皮條，浸泡于0.25% Dispase Ⅱ，置于4℃過夜。次日用眼科鑷撕取表皮皮片，D-Hank’s液沖洗3次，并用眼科顯微剪將其剪成1mm×1mm碎片，加入0.25%胰酶，37℃消化5～10min，用滴管吹打使細胞脫落，加入上皮細胞培養液中止消化，200目細胞篩過濾得細胞懸液，收集細胞懸浮液置于離心管內，以1500r/min離心5min，獲得消化所得的皮膚上皮細胞。將其以1×106個/mL密度接種于Ⅳ型膠原（100μg/mL）鋪底的培養瓶置于5% CO2、37℃細胞培養箱中待細胞貼壁20min后，去除未貼壁細胞，加入新的上皮細胞培養液，5% CO2、37℃細胞培養箱培養，1～2d換液一次。
1.2.3表皮干細胞與結膜上皮細胞共培養的誘導分化取1～2代表皮干細胞作為實驗細胞，以5×106個/mL接種于6孔Transwell培養板中，實驗組insert池中加入1mL結膜上皮細胞（細胞濃度為1×104個/mL）作為飼養細胞；對照組insert池中僅為相同體積的上皮細胞培養液，5% CO2、37℃細胞培養箱培養1、3、5、7d后，棄細胞培養液，分別取對照組和實驗組細胞提取RNA，進行實時定量RT-PCR檢測目的基因β2-微球蛋白、角蛋白K13的表達情況。
1.2.4細胞總RNA的提取吸出6孔Transwell培養板中的培養液，每孔加入1mL TRIZOL® Reagent，振蕩混勻，15～30℃溫育5min，每1mL Trizol加入0.2mL氯仿，振蕩15s，然后于15～30℃放置2～3min，于2～8℃離心樣品15min（＜12 000g），將上層水相移至新管中，每1mL原始Trizol用量加入0.5mL異丙醇，室溫放置10min，4℃離心（＜12 000g），棄上清，每1mL Trizol用量用1mL 75%乙醇洗滌，振蕩樣品，然后7 500g離心樣品5min（如果用來富集小分子RNA，則不用75%乙醇洗滌，直接進入下一步），空氣干燥RNA 10min，用適量RNase free水溶解，于60℃溫育10min，置于-80℃備用。
1.2.5引物的構建按照參考文獻[4]構建設計：β-actin正向引物：5’-CCTGTACGCCAACACAGTGC-3’，β-actin反向引物：5’-ATACTCCTGCTTGCTGATCC-3’；β2M正向引物：5’-GAATTGCTATGTGTCTGGGT-3’，β2M反向引物：5’-CATCTTCAAACCTCCATGATG-3’；CK13正向引物：5’-GAGGAATGGTTCCACGCCAAG-3’，CK13反向引物：5’-GCGACCAGAGGCATTAGAGGT-3’。
1.2.6PCR擴增取3μL逆轉錄反應產物做模板，根據試驗目的加入相應的正向引物和反向引物。PCR反應總體系為20μL。條件為95℃ 5min，1個循環；94℃ 30s，57℃ 40s，72℃ 40s，共30個循環；72℃ 10min，1個循環。
1.2.7熒光定量PCR按照SYBR（R）Premix Ex TaqTM試劑盒的說明書進行。取1μL逆轉錄反應產物做模板，20μL反應體系，引物濃度為10nM/μL，各加入0.5μL。SYBR（R）Premix Ex TaqTM 10μL，用雙蒸水補平至20μL。反應程序為94℃ 10s，1個循環；94℃ 5s，58℃ 31s，讀板，40個循環。數據分析采用2-CT方法。
2結果
Realtime RT-PCR的結果見圖1、圖2。結果可見實驗組表皮干細胞5d及7d后β2-微球蛋白mRNA的表達明顯上調，分別為（300±26）%（P＜0.01）、（300±13）%（P＜0.01）；CK13 mRNA表達上調（480±110）%（P＜0.01）、（760±53）%（P＜0.01）。與對照組相比，β2-微球蛋白mRNA及CK13 mRNA表達都有顯著性上調。
圖1表皮干細胞中β2-微球蛋白mRNA的表達水平5d實驗組細胞中β2-微球蛋白mRNA表達上調（300±26）%（P＜0.01）；7d實驗組細胞中β2-微球蛋白mRNA表達上調（300±13）%（P＜0.01），其中n=5，6
圖2表皮干細胞中CK13 mRNA的表達水平5d實驗組細胞中CK13 mRNA表達上調（480±110）%（P＜0.01）；7d實驗組細胞中CK13 mRNA表達上調（760±53）%（P＜0.01），其中n=5，6
3討論
角蛋白（keratin）是上皮細胞異性的中間絲成分。已知的細胞中表達的各種角蛋白家族亞單位成員具有組織特異性，并且和細胞的分化相關[5]。例如：Krenzer等[6]報道：在正常結膜上皮細胞中表達角蛋白K13/K4/K8/K19/K7。Dota等[7]研究報道：通過對38例正常結膜組織的上皮細胞建立的cDNA文庫，檢測出角蛋白K13是結膜細胞轉錄中表達最豐富的基因，且該基因與細胞骨架的合成有關，并認為K13有可能是有關眼表結膜細胞分化最敏感的基因。而且早期的研究中也證明：在結膜上皮細胞的免疫組化鑒定中結膜上皮細胞可被特異性角蛋白K13抗體標記，而在皮膚干細胞中并無相應抗體的表達[8]。
β2-微球蛋白（beta-2-microglobulin）是HLA抗原的成分之一。雖然有關該種蛋白的功能尚未明確，但是該蛋白存在于淚液中并可能來源于結膜上皮細胞中。并且在正常狀態下淚液中的β2-微球蛋白濃度明顯高于炎癥時淚液中濃度。Dota等[7]研究中也同時檢測到β2-微球蛋白也是結膜上皮細胞轉錄較高的基因，因此本研究將CK13和β2-微球蛋白作為結膜上皮細胞標記性（特異性）的高效表達基因。
近年來，相關文獻[9-11]報告了通過組織工程技術將成體干細胞體外合成生物替代品，并對其組織功能改良用于眼表重建的臨床治療新技術。然而，成功的眼表重建依賴于兩個重要因素。其一，具有高分化、高增殖能力的干細胞；其二，干細胞的載體組織。本研究中應用具有高分化、高增殖能力的表皮干細胞為種子細胞，從而保證眼表重建治療中能獲得可靠的細胞源。我們早期的相關研究中[4]報告應用同源異體的結膜去細胞基質膜為干細胞載體膜，不僅可保證具有良好的組織相容性，而且也確保在體外模擬形成結膜上皮細胞增殖的組織微環境。從而誘導表皮干細胞定向分化、增殖。
研究結果顯示經誘導分化的表皮干細胞在短時間內具有結膜上皮細胞的特異性基因CK13及β2-微球蛋白的高表達，提示該實驗方法可誘導表皮干細胞形成特異性短暫擴增細胞（TAC），并能定向分化為類結膜上皮細胞。因此，在臨床上眼表重建的干細胞療法應用中，該方法不僅可保證獲得充足的目的細胞來源，而且確保目的細胞具有穩定的生物學特性。在眼表結膜組織的重建及生理功能恢復的臨床治療中提供有效的組織來源。但是，該研究方法中誘導分化的表皮干細胞作為種子細胞能否合成人工結膜生物膜活體動物眼表的存活狀況及生理功能重塑方面的問題，還需要進一步的研究探索。
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篇10
1 無血清培養體系簡介
無血清培養體系是在合成培養體系的基礎上發展而來的，主要是尋找替代血清的各種可能性，使無血清培養既能進行細胞培養，又可以避免血清帶來的不利影響。與含血清培養相比，具有很多的優點，無血清培養技術的發展是從上世紀七十年代開始的，其中基于生產安全性的重組藥物而開發的無血清培養基，不用動物做為蛋白來源，降低了成本也加快了報批的速度，后來逐漸發展成為培養基的組成成分全部為化學已知物，更易進行目標蛋白的分離純化，要求培養的細胞要具有較高的特異性。
一般無血清培養體系由基礎培養和替代血清補充因子兩部分組成，其中基礎培養是零添加血清的合成培養基，按照細胞的生長要求將各種微量元素和營養物質進行合成為基礎培養基。補充因子是代替血清的各種因子，包括激素、生長因子、結合蛋白等，在所有的補充因子中，胰島素、轉鐵蛋白、亞硒酸鈉是細胞在無血清培養基中生長所必須的，是必須具備的補充因子。
2 無血清培養體系在再生醫學領域的應用
2.1 無血清培養基研制配方的應用
研究人員研究發現在無血清合成輸卵管液培養基中加入胰島素、轉鐵蛋白和硒，可以提高動物胚胎的發育質量，再加入牛血清白蛋白后，可以促進囊胚的發展，可以促進細胞的增殖實驗。CHO、Vero等工程細胞是單克隆抗體和基因工程藥物的表達載體，在對無血清培養基的研制時，要滿足增殖的需要，同時也要表達目的產物。例如CS-NS0細胞是抗-CD25單克隆抗體的表達體，無血清低蛋白培養基可以滿足大規模培養和抗體表達的要求，批培養最大活細胞密度和最大抗體濃度都達到很高。基于人胚腎細胞培養的無蛋白培養基，可以用于對抗聚乙烯介導轉染慢病毒，具有較高的滴度，成本也較低。針對Vero細胞源乙型腦炎疫苗而研制的無血清培養基，沒有任何動物源性成分，疫苗只要添加穩定劑，就可以在常溫下保存。
2.2 無血清培養體系在細胞增殖方面的應用
雌二醇是無血清培養基中經常添加的激素，如果其濃度較高，會抑制毛囊的生長；PDGF、TGF-β、FGF是三種信號通路，可以促進間質干細胞的生長分化，如果其中之一受到抑制作用會影響間質干細胞的生長，如果三種信號通路結合好，則會使間質干細胞在培養基中傳到五代。如果無血清培養基鈣濃度較低，下調Smad蛋白介導會維持角膜基質細胞的表型，角膜的上皮細胞也可以長期進行傳代培養。中草藥是我國的傳統醫學代表，細胞無血清培養技術也影響到中草藥的作用機制，研究顯示黃芪可以增加人皮膚表皮干細胞將粒酶轉化為錄酶，并增強其活性。
2.3 無血清培養基在細胞和組織移植中的應用
無血清培養體系安全性較高，所以廣泛應用于基于生物細胞培養的細胞或組織移植治療中。在無血清培養基中培養骨髓基質干細胞，可以獲得與含血清培養基相同的增殖效果，如果患者屬于特殊貧血類型并且體重較輕，可以誘導人體成骨，并可以抑制異位骨，這方面比含血清培養更具有優勢。采用脂質體轉染法轉染骨髓間充質干細胞，可以在無血清培養的條件下抑制細胞的凋亡，使骨髓間充質干細胞可以存活于下肢缺血性疾病的治療中。
如果某些細胞和組織具移植的可能性，如果研制的培養基可以長久的維持細胞特性，這將會促進移植的成功率。新鮮剛分離的肝細胞具有特有的分化屬性，此屬性如果存在于含血清培養基中就會喪失掉，如果在無血清培養基中添加地塞米松、表皮生長因子、垂體提取物等，肝細胞就會保持3-4周的分化屬性，這對于需要肝部移植的患者來說，是一大福音。對由幼年牛軟骨外植體組成的無血清培養基進行觀察后發現，外植體的力學性能和生物含量得到了有效的加強，其性能一直比較穩定，細胞充滿活力。含血清基外植體的力學則有所下降，并且損失了一定的聚糖并發。這充分說明了無血清培養基可以延長成熟細胞的特性，在組織互作無血清培養體系中，需要添加特定的材料來介導才能促進上皮間質的互作。
2.4 無血清培養基在腫瘤治療方面的應用
無血清培養基具有許多優點，包括可以使細胞生存所需的營養物質得到保證，除掉了血清中的促分化劑，對于腫瘤的發現和治療具有重要的應用價值。無血清培養可以增加SP2/0細胞中的瘤細胞，這些瘤細胞都具有干細胞特性，可以將SP2/0中的腫瘤干細胞進行富集。細胞外基質可以影響腫瘤細胞的存活、增殖和遷移，無血清培養基中加入纖維連接蛋白后來培養人乳腺癌細胞，可以上調基質 金屬蛋白酶的活性。單克隆抗體可以阻斷整合素，可以抑制基質金屬蛋白酶的活化反應。在進行腫瘤治療時，對體外誘導擴增CIK細胞及抗腫瘤活性進行研究，分別采用無血清培養和含血清培養基，結果顯示無血清培養基可以代替含血清培養基，某些方面還有含血清培養沒有的優勢。研究人員研究了適合于B16黑色毒瘤細胞培養的無血清培養基，對樹突狀細胞進行預防。這說明無血清培養的免疫活性細胞可以用于腫瘤的生物免疫治療。
2.5 無血清培養基在外周血淋巴細胞抑制中的應用
抑制外周血淋巴細胞的無血清培養基是一種生物制劑，主要成分是凝集素、基礎培養基和血清替代物，其血清替代物包括牛血清白蛋白、重組人胰島素、檸檬酸鐵和氨基酸母液，外周血淋巴細胞培養基不用動物或者人的血清，不僅降低了培養基成本，還可以降低疾病的傳播，此淋巴細胞培養基可以增強淋巴細胞的轉換率，促進淋巴細胞的分裂，抑制效果顯著，可以廣泛用于染色體核型的臨床診斷，是康復率低的淋巴疾病的福音。
3 小結
無血清培養體系具有含血清培養體系無法達到的優勢，但需要在培養通用性、生產高效性以及成本和安全方面進行改進，未來隨著對細胞營養、細胞代謝 、細胞凋亡以及外源蛋白表達等的不斷研究，采用更多的科學實驗方法，可以使無血清培養基的開發更加快捷，使模擬細胞微環境的無血清培養體系可以廣泛應用于生物科學領域，特別是再生醫學領域，為更多的疑難雜癥以及再生性疾病提供更多的服務。
參考文獻
篇11
骨髓間充質干細胞(MSCs) 具有多向分化潛能，可以在體外誘導分化出肝干細胞，此種骨髓源性肝干細胞可以為肝組織移植工程提供新的細胞來源。近年來的研究主要集中于體外誘導MSCs為肝干細胞，此種細胞具備了肝細胞的形態，在體外能夠表現出一定的肝細胞功能〔1〕，但對骨髓源性肝干細胞在體內的定居和定位能力情況尚不明確。本實驗通過對大鼠MSCs進行體外培養，誘導、分化出肝干細胞，同時建立暴發性大鼠肝衰竭模型，探討骨髓源性肝干細胞同種異體移植后在受體大鼠模型肝內定居情況。
1 材料與方法
1.1 材料
低糖DMEM培養基(Invitrogen)、Percoll(Pharmacia，比重1.077 g/L)(Gibco公司)、胎牛血清(杭州四季青)、胰蛋白酶2(Sigma)、肝細胞生長因子（HGF)(CYTOALAB公司)、細胞培養箱(Forma公司)；純系SD大鼠、3周齡、體重100～120 g(供體大鼠)和成年純系SD雌性大鼠、體重180～220 g(受體大鼠)，由吉林大學實驗動物中心提供。
1.2 骨髓源性肝干細胞培養
1.2.1 MSCs分離、培養及定向肝干細胞的誘導分化
從供體SD大鼠股骨提取骨髓細胞。用比重1.073的Percoll分離液行MSCs分離，加含抗生素及10%小牛血清的IMDM培養和擴增，取第3代MSCs加入HGF(20 μg/L)誘導定向肝干細胞分化。
1.2.2 誘導后的骨髓源性肝干細胞鑒定
用ELASA法檢測細胞培養液中的甲胎蛋白（AFP)、白蛋白（ALB)。用免疫組化法檢測細胞中細胞角化蛋白（CK)18、CK19和波形蛋白（Vimentin)的表達。
1.3 肝損傷動物模型的制作和分組
受體雌性SD大鼠20只，隨機分為正常大鼠組和肝損傷組。肝損傷組用質量濃度10%D氨基半乳糖溶液一次腹腔內注射，劑量1 200 mg/kg體重。
1.4 同種異體大鼠骨髓源性肝干細胞移植
正常組大鼠和肝損傷組大鼠，分別以戊巴比妥麻醉，仰臥位固定，常規消毒、備皮、鋪無菌巾，上腹正中切口，長約1 cm，于肝中葉以BD胰島素注射器注射肝干細胞懸液0.4 ml（107/ml )，觀察無出血后縫合傷口。
1.5 受體體內移植骨髓源性肝干細胞鑒定
應用PCR技術檢測性別決定因子基因片段(sex determining region of the Y，Sry)。干細胞移植后1，2，4 w后取受體肝臟移植原位(注射部位)、鄰位(距注射部位0.5 cm)組織，應用PCR技術檢測〔2〕性別決定因子基因片段(Sry)。引物按文獻〔3〕設計，由上海Casarry生物有限公司合成序列，外引物對SRY1/ SRY2擴增片段大小為317 bp，內引物對SRY3/SRY4擴增片段大小為121 bp。
2 結 果
2.1 骨髓源性肝干細胞的培養結果 大鼠MSCs經原代培養，細胞傳代，誘導分化，細胞異形性較誘導前增加，表現為圓形、橢圓形細胞數量較誘導前明顯增加，而梭形細胞數量減少，誘導培養10 d左右，細胞形態表現為圓形、橢圓形細胞為主，梭形細胞已極少見。免疫組化染色，二氨基聯苯胺（DAB)顯色，在倒置顯微鏡下，可見細胞形狀顯圓形或卵圓形，胞漿內出現棕黃色顆粒。CK18、CK19、Vimentin呈陽性表達。細胞培養液中AFP、ALB含量誘導前分別為(0.021±0.008) ng/ml和(0.72±0.14) g/L；誘導后分別為(0.403±0.042) ng/ml，(6.1±0.32) g/L。誘導后的AFP、ALB含量明顯高于誘導前（P＜0.05)。表明經誘導的MSCs分化為肝干細胞。見圖1。
2.2 肝損傷模型病理結果
D氨基半乳糖注射后，大鼠肝臟肝索紊亂，肝細胞腫脹變性、灶性及大片壞死，伴出血及炎性細胞浸潤。見圖2。
2.3 性別決定因子基因片段檢測結果
肝損傷組：檢測1 w時陰性，2 w時原位肝組織Sry陽性表達，鄰位未表達，而4 w時原位及鄰位組織檢測到Sry表達，原位表達較2 w時增強，鄰位較弱。正常肝臟組：1及2 w均未檢測到表達，4 w時檢測到原位微弱表達。見圖3。
3 討 論
MSCs具有多向分化潛能，特別是具有向肝臟干細胞、肝細胞及血管內皮細胞分化的潛能〔4〕，因而有望成為肝組織移植工程新的種子細胞來源。由于MSCs是成體干細胞，取材方便，可以來自患者自身，無排斥反應，故具有重要的臨床應用價值。本實驗根據文獻報道〔5〕，使用HGF，使MSCs分化為肝干細胞，對骨髓源性肝干細胞同種異體移植后在受體大鼠模型肝內定居情況進行初步研究。
目前研究表明移植肝干細胞可存活于受體許多部位包括肝、脾、腹腔、胰腺、肺、腸系膜、腎及腎脂肪囊、腹膜后等部位〔2，6～8〕。肝臟由于其獨特的營養環境、生理及解剖結構環境無疑是最理想的場所，可經門靜脈輸入或肝實質植入，該組實驗采用肝臟植入方法，取得較好效果，說明此方法是安全可行的。本實驗采用同種異體移植，應該考慮免疫排斥反應，但文獻報道，純化的MSCs具有獨特的免疫原性，進行同種異體移植不需要預先應用免疫抑制劑，無免疫排斥反應，是良好的基因治療靶細胞。
目前鑒定受體體內被移植后的肝干細胞有許多方法，其中較為常用的是以雄性動物為肝干細胞供體〔1〕，雌性動物接受細胞移植后，分化增殖的細胞 Y 染色體陽性，證明雌性受體內存活的細胞來自雄性供體細胞，這就可以清楚地將植入的細胞與原有的細胞區分開來，進一步研究移植作用，本實驗采用雄性供體細胞為雌性受體移植，檢測移植部位細胞的Y染色體表達情況，進而檢測移植細胞是否定植。
實驗結果顯示，移植后2 w肝衰竭大鼠移植原位檢測到表達，4 w表達明顯增強，而且臨近部位出現表達；正常大鼠在移植后4 w移植原位出現微弱表達。實驗證實，骨髓源性肝干細胞在正常大鼠肝臟及肝損傷大鼠肝臟內均能定居，但在肝損傷大鼠肝臟內定居能力明顯增強。考慮可能為大鼠肝損傷后，刺激機體分泌出各種促進肝細胞再生的生長因子，為移植細胞提供定居所需的微環境。文獻報道，在正常大鼠體內，HGF等因子的活性是被抑制的，只有在肝損傷時，啟動肝再生程序，這些因子才能被激活，引起肝細胞有絲分裂。
本文通過實驗證實了大鼠骨髓源性肝干細胞移植后可以定居于受體肝臟內，而且在肝損傷后有利于干細胞移植的定居，這為下一步研究定居于肝內的骨髓源性肝干細胞的功能奠定了基礎。
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篇12
2007年，科學家利用干細胞技術，在培養皿中成功地將皮膚細胞培養成誘導多功能干細胞，這種干細胞具備類似胚胎干細胞的功能，能夠根據需要分化成不同的細胞。早期的神經細胞培育正是在這種迂回技術下實現的，但是由于這種技術誘導多功能干細胞不僅轉化時間過長、程序繁雜，而且容易引發癌癥等風險，所以未能成為成熟的技術。
2010年，科學家繞開了誘導多功能干細胞的繁雜步驟，成功將實驗鼠的皮膚細胞直接轉化成神經細胞，并在此基礎上，成功將人體皮膚細胞直接轉化成神經細胞。
培養神經細胞的新技術
篇13
關鍵詞 毛發；移植；研究
[中圖分類號]R737.33[文獻標識碼]A[文章編號]1674-0742（2015）04（a）-0189-02
[作者簡介]周洪星（1974-），男，四川成都人，大專，主治醫師，研究方向：致力于FUE-AHT-NFS體系毛發移植技術的臨床研究與應用。
自19世紀20年代開始對毛發移植技術進行研究以來，毛發外科移植技術的發展就方興未艾，其中已經應用的主要有禿發頭皮縮減外科、頭皮自體移植技術以及毛囊單位的移植技術等。在西方國家，因為近代科技的發展其毛發移植技術相對國內來說更加先進，自體毛發移植技術經過過去上百年的摸索以及發展，移植之后毛發的成活率已經得到了顯著的提升且形態更加接近自然美。
現今，在臨床上所采用的毛發移植技術多樣，各方面的技術手段都有。該文就多年毛發移植行業的經驗對其發展的現狀以及進展等前景做一個綜述。
1 新型毛發移植技術臨床應用
1.1 毛發移植基礎理論
在整形行業內，大多數學者還是認為“供區優勢理論”是毛發移植之后所產生的生物學行為最為主要的。也就是在移植之后毛發仍然具有在供區上生長的特性，并且能夠在受區之內長時間存在。患者在進行毛發移植以后，其移植部位的微生態環境可能會因為雄性激素的水平不同而發生改變。大量數據研究表明，毛囊干細胞不僅僅只在毛囊的周期生長之中有著重要的作用，也是表皮進行自我修復和更新的基本來源[1]，這一理論就是現代外科毛發移植技術成功的基礎。
現展的毛發移植手術最重要的進展就是從供區進行切取，然后制備毛發的皮片并植入受區內微小的移植技術。“微型毛胚”一般包含有1~2根毛發；“小型的毛胚”包含有3~4根毛發，大多數條型毛胚以及方型毛胚等均屬這一類型。直徑2~4mm毛胚被稱為標準性毛胚，普遍含有7～8根毛發。
1.2 毛發自體移植技術
1.2.1 毛囊單位移植技術和立體顯微鏡的應用 采用十倍雙目放大鏡從全厚的頭皮上自然切取所獲得的成簇毛囊平均存在1~4根毛發/每簇，然后再借助手術刀將標準成簇毛囊植入到禿發區內的針孔，也可以將毛囊簇及周圍存在的皮膚植入到頭皮之上所切的縫隙之內。毛囊單位移植技術的優勢就在于能夠得到較高毛發的密集程度，一次手術可有使得每平方厘米植入大于60根毛發。其短處就是手術以及護理所需要花費的時間很長。這項研究技術倡導者認為，這項技術相比于非顯微鏡移植的毛發損傷比例至少小于20%，但是研究顯示毛囊的橫斷面以及毛球的切除不會像想象中那么重要。只要毛囊還存在著干細胞，毛發就能夠再次生長[2]。這就是爭論的核心觀點。大量研究已經證實，采用顯微鏡能夠少用20%的供區皮。當供選擇的區域無法足量的時候，就必須首選顯微鏡制備。
1.2.2 超密度植發 現今在臨床上已經有醫生傾向于進行一次手術移植大于一千個以上的微小毛發皮片段，這就是所謂的“超密度植發”，進行“超密度植發”能夠使得移植結果更為迅速且效果更為優良。不過這種方式有潛在的醫學問題：就是在臨床上，每次手術都要移植超過600束，而移植600束的時間大約為4h，移植到1200束則需要6h，這對于醫生和患者來說都是一個極其漫長而難熬的過程，醫生能否堅持那么久而不疲勞，患者是否能夠耐受住手術的長時間。如果患者的受區面積較大，或者其頭皮較為腫脹，移植物就可能會出現壓迫進而影響到毛發生長，供區的頭發有一定的概率被全部取完。所以對于毛發移植手術來說，手術的方式以及手術的對象就顯得極為重要，而且在臨床上還是要考慮留有足夠的供區頭發以作為備用。在臨床上采用超密度植發的時候需要進行技術評估，這種方案能實現更好的治療效果，但是會存在手術過程漫長等缺點。
2 組織以及基因工程在毛發移植技術方面的應用
組織工程以及基因工程對于毛發移植方面主要能夠彌補患者供區面積不足，也能夠最大限度地去減少患者的痛苦，實現毛發移植的微創，也能夠培養出和受體兼容性更佳的供選擇毛發。
2.1 毛囊的體外培養與原位細胞培養
現今存在于毛發自體移植中，矛盾實際上就是毛發需求量大而供區毛發量小。這就表明通過組織工程學進行體外毛囊細胞擴增就能夠解決這個矛盾，而且離體對毛囊進行培養也對弄清毛囊生長以及成熟的各方面影響因素有莫大的幫助。現今對于人類毛囊的體外培養技術也已經在技術上取得成功，不過還是其應用到臨床還需要更多的工作去完善。也有學者提出了“克隆療法”的概念，這種療法在本質上來說其實也就是一種自體細胞增殖技術[3]。這個方法跟體外克隆是一個道理，就是在患者身上取小塊帶毛發的頭皮，對毛囊干細胞進行分離然后培養增殖，在所培植的細胞數量達到一定級數后，再將增殖的皮毛進行禿發區的移植，這種技術手段現今已經通過動物實驗得到了驗證并取得成功。不久的將來就可能會應用到人體。這當中可能會用到特制原位細胞培養基（CCM），這種培養基就是把胰島素以及生長激素等加入到培養基之中制成凝膠，能夠用來外用。原位細胞培養基主要作用就是加快毛發的生長并抑制毛發掉落，其機制就是通過刺激上皮再生功能。美國學者Lindenbaum等對以原位細胞培養基治療的脫毛患者進行了隨機雙盲研究[4]，時間長為6個月，顯示以原位細胞培養基1~3mL，然后封包3個小時進行治療，發現治療組患者的平均毛發生長較正常組更優，數據比較兩組存在明顯差異（P<0.05）
2.2 2脂質體毛囊傳遞系統與基因治療
法國學者多馬申科等在免疫缺陷小鼠身上植入人類的皮膚，在移植物表明應用Lipo plex[5-6]。其研究結果表明，在超過兩千四百個毛囊為研究對象中發生轉染的細胞只是毛囊干細胞，并且在Lipo-plex之前對移植物進行拔毛處理以增加轉染比例。這個試驗研究表明毛發生長的初期，采用Lipo-plex可以達到基因選擇性表達到干細胞中并且發生轉染，進而影響到毛發自身的生長特性。這個試驗證明的結論對于改變毛囊表型并實現基因治療毛發疾病理論有著極大的影響，打下了較為可信的基礎研究。在現今，禿發基因也已經被科學家所發現，這個基因有助于對人類毛發再生機制進行研究，并開發出治療禿發的新途徑。
3 結語
在此還值得一提的是就是法國一家從事生物技術的公司最新研發了Calviron頭發種植系統，這個系統擁有著許多優勢[7-9]，其優點表現在：毛發獲取的周期短，在手術室采用刀片組對一直發片進行移植，最多時能夠在一次手術取5條發片。然后將發片置于自動分割器之中，一次性壓取得到超過500個移植的發片。如果頭皮條自身的長度超過了10英寸，則采用多次壓取技術就能夠得到規格都較為均一的微小發片，其最大的缺點就是對毛囊沒有精準的識別功能，這會極大地增加手術對毛囊的破壞作用，并且在手術前必須進行特殊的培訓，手術所用工具為鉆孔手機，能夠實現快速鉆孔。并且控制極為方便，能使得孔徑密度以及大小相互一致。熟練的操作人員能夠在不到15 min打孔到500個。到現在已經存在第二代產品“Omnigraft頭發種植系統”，其設備的治療效果更為顯著。
在現今，較為主流的毛發移植技術還是以患者自身存在充分供毛區域為前提的。這就使得對那些需要移植的面積大或者毛發完全缺失的患者來說，這種主流毛發移植技術就很難展開了。這些治療方法本身都產生新毛發區域，也無法達到增加毛發數量的目的。因此，供區毛發資源缺失的問題就極為明顯了。這個矛盾已經是現今毛發移植領域極難解決的問題。許多學者針對這些問題進行多方面研究和考證，在假發的移植領域，易斌等采用聚丙烯材料頂端固定假發移植進行試驗，為臨床的最終應用打了良好的基礎。Agrawals在臨床上對治療失敗的10名男性脫發患者進行共聚多酰胺纖維治療[10-11]，每個人采用1000根纖維，然后在手術后3年時間內進行隨訪，隨訪的患者每年毛發的掉脫比例低于20%。也有使用尼龍材質來作為供發的報導，不過這種方式極其容易導致患者出現感染以及排異，導致其在臨床上極少使用，隨著現代材料學大力發展，這中方法依然被廣泛關注，也是現階段較為有效的一個研究熱點。異體移植的手段現在也是一種被認可的治療方式。異體之間的毛囊移植也被強烈關注。Reynolds等就成功把毛囊的球部進行同種異體移植技術，這個技術在最后發現不會出現異體免疫的排斥作用。現在大量的研究證據已經證明了嚙齒目動物的毛囊間都會存在或多或少的免疫逃逸。這使得異體毛囊移植技術在臨床上具有較好的前景。
伴隨著現階段基因以及組織工程技術方面的大力發展，許多國內外的專家已經提出毛發干細胞篩選[12]。對人類的毛囊體外培養獲得了巨大成功。不過現今毛囊的離體培養技術還是有著亟待解決的瓶頸，臨床應用還十分的遙遠。原位干細胞培養已經在創傷修復研究中取得了成功。徐榮祥等認為斑禿病患者的毛囊干細胞發生萎縮，重啟毛囊干細胞的復活就成為毛發再生的技術核心。許多研究也已經證實，毛囊干細胞能夠實現直接下移，或者直接在毛囊的干細胞地方生長出新的毛囊，濕潤技術實際上就是培植毛囊，促進局部微循環的改善。最終生長出正常的毛發。徐榮祥發現采用濕潤技術能夠實現皮膚的再生愈合，最終發現成年皮膚干細胞原位培養對于毛發治療方面有著較大潛力。這一結論能夠為后面的研究者帶來更好的啟示，皮膚或者毛囊的干細胞工程學的研究也最終必然會為毛發移植領域帶來長遠的意義。不過相比于現今較為成熟的自體移植以及高密度植發技術而言，來自基因工程和組織工程方面的技術手段來相對不成熟，大多數試驗還停留在實驗室的研究階段，即使偶見有臨床報導那也是極少的個例，在臨床上大范圍應用還有相當長的路要走。
參考文獻
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