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1.2蛋白質載體
納米材料在診斷、藥物輸送、生物功能材料、生物傳感器等方面得到了迅猛的發展,出現了疾病治療、診斷、造影成像等多種功能的組合。無機納米材料在生物大分子藥物的載體,包括運載蛋白質、多肽、DNA和siRNA等方面的研究較多。納米多孔硅有較好的生物相容性、生物可降解性和可調控的納米粒徑,可作為藥物輸送系統。殼聚糖修飾多孔硅后可用于運載口服給藥的胰島素,改善胰島素的跨細胞滲透,增加與腸道細胞黏液層的表面接觸,提高細胞的攝入,可用于口服遞送蛋白質和多肽。納米羥基磷灰石與蛋白質分子有高親和性,可用作蛋白質藥物緩釋載體,能提供鈣離子,造成腫瘤細胞過度攝入,從而抑制腫瘤細胞活性,誘導腫瘤細胞凋亡。
1.3基因載體
基因治療是遺傳性疾病的臨床治療策略,主要依賴于發展多樣性的載體。無機納米材料用于基因療法是利用無機粒子和可生物降解的多聚陽離子合成新型的納米藥物載體,如介孔二氧化硅作為基因載體可用于腫瘤治療,促進體外siRNA的遞送。乙醛修飾的胱氨酸具有自身熒光的特點,可對pH值和谷胱甘肽進行響應。通過熒光標記類樹狀大分子的二氧化硅納米載體具有分級的孔隙,不僅毒性低、基因裝載率高,轉染率也較高。引發谷胱甘肽二硫鍵裂解,可促進質粒DNA(pDNA)釋放,并能使用自發熒光來實時示蹤。又如,通過π-π共軛、靜電作用等非共價鍵作用力結合,能將DNA、RNA等生物大分子和化學藥物固定在氧化石墨烯上。
1.4骨移植
臨床上可用自體骨移植來治療創傷、感染、腫瘤等造成的骨缺損,由于骨移植的來源有限,且手術時間長,易導致失血過多和供骨區并發癥等,應用受到限制。將異體骨用作骨移植,則存在免疫排斥反應,且易被感染。而人工骨同自體骨有相近的療效,人工骨材料可采用鈦、生物陶瓷、納米骨、3D模擬人工骨髓等納米材料。例如,納米二氧化硅可替代骨組織,促進人工植入材料與肌肉組織融合。納米羥基磷灰石與人體內的無機成分相似,其粒子有小尺寸效應、量子效應及表面效應等,可用作牙種植體或作為骨骼材料,能避免產生排斥反應,促進血液循環,促進人體骨組織的修復、整合和骨缺損后的治愈。
1.5臨床診斷和治療
磁性氧化鐵納米粒子可作為造影劑用于腫瘤診斷中,對腫瘤分子產生磁共振分子影像或多模態腫瘤分子影像,也可用于循環腫瘤細胞的分離、富集。免疫磁分離法基于磁性雜化材料可導電,在外部磁場下積累,可用于臨床熱療。磁熱療以磁流體形式進入腫瘤組織,利用腫瘤細胞與正常細胞之間不同的熱敏感度,將外部磁場產生的磁能轉化成熱能從而殺死腫瘤細胞。磁性納米粒子還可用于生物傳感器中,利用磁現象和納米粒子從液相中分離并捕獲生物分子。用綠色熒光蛋白標記,形成溫敏的磁性納米固相生物傳感器,用磁性材料制成固相生物傳感器的支架,在磁場作用下,響應更快,表面易于更新,可用于免疫診斷。磁性納米氧化鐵作為臨床應用的磁性納米材料,受到人們的廣泛關注。Fe3O4和γ-Fe2O3的特殊磁性質使其在靶向腫瘤藥物載體、磁療、熱療、核磁共振成像、生物分離等生物醫學領域中得以應用。用無機納米材料制作激發熒光探針進行臨床診斷,如用介孔二氧化硅制成的細胞熒光成像探針利用量子點良好的光穩定性、較長的熒光壽命和較高的生物相容性,結合介孔二氧化硅可特異性地識別Ramos細胞的特點,并用激光共聚焦顯微鏡對Ramos細胞進行熒光成像,實現了對腫瘤細胞的早期診斷、檢測成像。富勒烯特殊的結構和性質使其可以廣泛地應用于光熱治療、輻射化療、癌癥治療等醫學領域,也可作為核磁共振成像的造影劑用于臨床診斷。但富勒烯不溶于水,對生物體存在潛在的毒性,限制了其在臨床的應用。富勒烯結合含羥基的親水性分子可改善其溶解性,羥基化富勒烯無明顯毒性,可作為抗氧化劑。聚羥基富勒烯利用近紅外光激活體內的納米材料,用光熱對腫瘤細胞定位,避免了金納米粒子、碳納米管等在體內造成聚積,利用免疫刺激作用來抑制腫瘤細胞的轉移、生長,從而減小腫瘤的尺寸,最終造成腫瘤細胞凋亡。因此,改造碳納米結構,在成像、吸附、藥物裝載與靶向運輸等生物醫學工程方面有潛在的應用價值。銀納米粒子殺菌活性遠高于銀離子,在殺菌抑菌方面得到廣泛的應用,可用于外科手術中的傷口愈合、藥學、生命科學等生物和臨床醫學領域。金納米粒子有較好的生物相容性,功能化的金納米粒子可用于生物分析、藥物檢測、臨床診斷等生物醫藥領域,可作為納米探針檢測重金屬離子、三聚氰胺等小分子,也可檢測DNA、蛋白質等生物大分子,還可以用于對細胞表面和細胞內部的多糖、核酸、多肽等的精確定位。鎳納米粒子固定在海藻酸水凝膠中,通過熱敏感粒子與鎳磁納米粒子交聯形成囊狀結構,組成熱磁雙敏感的磁性納米粒子。在交變磁場下緩慢釋放水凝膠中的鎳納米粒子,通過遠程調控來激發水凝膠中成纖維細胞的凋亡。無機納米材料的類別不同,在尺寸、形貌上有很大的變動范圍,因其核心材料的量子特性,已日益成為涉及臨床診斷、成像和治療的手段,為納米材料在生物醫學上的應用提供更多的可能。
2展望
納米技術作為新時代的疾病治療模式,為未來的臨床用藥提供了新的可能,在生物醫學的應用上有很大的前景。目前,癌癥治療主要包括手術、放療和化療等手段,而藥物劑量增多會造成副作用。納米粒子可以作為靶向藥物載體、成像造影劑、化療、熱療、磁療系統,可通過血腦屏障,在治療神經系統疾病中有很大的潛力,有望成為攻克癌癥的新手段。無機納米材料在藥物載體、臨床診斷和治療等方面有廣闊的應用前景,但目前的研究大多處于實驗階段。無機納米材料在生物醫學應用中有待解決的問題包括:
(1)提高疾病治療的針對性、靶向性和可調控性;
(2)使無機納米材料相對固定在腫瘤細胞表面,不至于擴散到正常組織,從而提高腫瘤部位的有效濃度,減少毒副作用;
(3)納米材料有潛在的毒性,可降低納米材料的毒副作用以達到臨床應用的標準;
(4)尋找優質材料,優化結構,提高材料的生物相容性、生物安全性,并針對不同的藥物溶解性設計特定的載體和功能材料骨架,增加細胞的攝取和利用;
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1 醫學生首先應了解醫學科研的概念及分類
科學是知識和學 問之意,是在一定社會環境中對知識的探求,而醫學是科學的分支,是一門古老的科學。醫 學作為一種認識現象,是一種特殊的社會意識形式,是關于人體正常和異常的生命過程以及 同疾病作斗爭和增進健康的科學知識體系,是人類長期與疾病作斗爭的實踐經驗的總結。醫 學研究是一種自然現象,它研究對象是人,它主要研究人體生命過程及其與外界環境的相互 關系規律,研究人體疾病的發生、發展、痊愈及其防治的規律,研究增進人類健康、延長人 類壽命和提高勞動能力的有效措施。根據研究對象、內容和方法的不同,把醫學科學分為基 礎醫學、臨床醫學和預防醫學?;A醫學是研究人體的生命活動和作用于人體的致病因子、 藥物、毒物以及疾病發生發展的本質和普遍規律的科學體系,是整個醫學發展的基礎和先導 。臨床醫學是研究認識疾病和治療疾病的科學體系,是醫學中的技術科學和應用科學的龐大 體系。預防醫學是研究預防和消除病害、講究衛生、增強體質、改善和創造有利于健康的生 產環境和生活條件的科學體系。以上的分類不是固定不變的,它將隨著醫學的發展而發展。 傳統的醫學分類已經不能充分地概括醫學領域各分支學科的現狀和全貌?;A醫學、臨床醫 學、預防醫學三者相對獨立的傳統界線會日益模糊,三者之間相互滲透,漸趨融合,各種新 的學科分支不斷產生。
2 醫學科學研究促進了醫學的發展
隨著社會的發展,科學在社會中地位越來越重要,醫學作為科學一個分支也如此。20世紀以 來,現代醫學以空前的速度向前發展,為保障人類的生命和健康作出了重大貢獻。未來醫學 發展前景如何?人類將遇到哪些困擾?將采取何種對策去迎接未來的挑戰。這就需要醫學院 校的學生打下扎實的科研基礎去面對。
2.1 近代醫學研究的發展
醫學的產生已有4000多年,早在文藝復興時代,比利時醫生維薩里就明確宣言:“我要以人 體本身上的解剖來闡明人體的構造。”他還認為科學不應該盲從,必須從實際出發,因此不 顧教會不準解剖尸體的禁令,夜間從刑場偷回尸體,從事人體解剖的研究。1543年,維薩里 發表了《人體的構造》,奠定了人體解剖學的基礎。1628年,英國醫生哈維在活體實驗的直 接觀察的基礎上,發表了《論動物的心臟運動與血液運動》,把生理學確立為科學。自此人 們由認識人體的結構形態進而認識活體的生理功能,開始了近代醫學的新時代。
18、19世紀,近代醫學取得了巨大進展,主要標志為實驗生理學的發展,細胞病理學的 建立,科學的微生物學說的興起。近代醫學研究均以實驗觀察為基礎,用實驗中觀察到的事 實來做結論。它們的特點為:分門別類,各自孤立的研究,由于分門別類的研究,積累了許 多新的事實,引起了近代醫學進一步分化。例如比較生理學、病理生理學、病理解剖學、胚 胎學、微生物學等,都形成了獨立的學科。
2.2 新世紀當代醫學研究的發展
二十世紀當代醫學發展的特點是人們的認識向微觀的深入和宏觀上的擴展,自然科學分科的 進一步發展,互相錯綜,形成一個網絡式的整體系統。醫學科學也隨著現代科學技術的重大 成就,發生了巨大的變化,從而形成了新的歷史特點。當代醫學科學發展具有既高度分化又 高度綜合的新特點,有力地表明了醫學研究既是多樣的,又是統一的。馬克思早就指出了科 學統一的前景,他說:“自然科學往后將包括關于人的科學,正像關于人的科學將包括自然 科學一樣,這將是一門科學”[1]。
醫學的分化趨勢與整體化趨勢:①新技術提供現代化研究手段,對人體和疾病的研究達到分 子水平,正向量子水平前進。這就促進了學科的高度分化,例如,當今的遺傳學就發展了許 多分支,諸如:毒理遺傳、免疫、生態、行為遺傳學等。傳統外科也出現了許多分支,例如 :普外、胸外、腦外、顯微外、移植外、整形外等。②整體化趨勢主要表現為臨床與基礎的 統一,預防與臨床、基礎的統一,例如:環境醫學、人體力學,生物材料學等。大生物學的 誕生就是當代醫學高度整體化的重要標志,它是把地球上所有以生物為研究對象或研究材料 的學科集合起來,對比它們的特性、相互關系及其地球環境對它們的影響。如地球溫室效應 、厄爾尼諾現象等。此外,中西醫理論上的結合也變成可能。西方醫學的成功是分析方法和 手段的勝利。而它的缺點主要是缺少整體觀與系統論造成的。西醫向更高層次的發展,將是 在實證科學的基礎上,吸收系統與整體論的觀點,走向生命現象的復雜系統論。這就是生物 模式向“環境-社會-心理-生物”模式轉變的基礎,也為中國傳統醫學與西方現代醫學在更 高層次的結合、創立“統一醫學”提供了可能性[2]。
總之,新世紀的醫學科研正向兩極方向高度發展,一方面向細胞分子、量子、納米生物學深 入。另一方面,則向有關種群生態及生物圈的研究領域展開。學生必須從這些醫學科研導論 中理解這些前瞻性知識對將來醫學臨床和科研的重要性,增加對醫學的興趣和作為醫生的責 任感。新世紀醫學的任務將從以防病治病為主逐步轉向以維護和增強健康,提高人的生命質 量為主,未來尋求醫學服務的不僅是患者,還有相當數量的正常人。尋醫問診的不僅是身體 缺欠,更多的是得到生活指導和心理咨詢,醫生開出的不僅是藥方還有生活處方。
3 研究方法
科學研究是以研究自然界物質運動規律為直接目的的,在實驗中,人們可以根據科學研究的 目的和要求,借助一些特定的儀器和設備,造成在研究中某些對象所需要的特殊條件,控制 某些因素或排除一些不利因素,把要研究的問題進行精細地、反復地觀察和研究,最后得出 科學結論。科學研究史的無數事例說明,科學研究已經成為科學知識新的源泉。醫學院校學 生需要掌握以下幾方面科研基礎知識和研究方法。
3.1 醫學研究的特點
醫學研究是認識疾病,掌握它的發生和發展過程,提示健康與疾病的轉化規律。因研究的對 象為人體本身,故在形態學、生理學具有生物學屬性外,在語言、思維和社會生活上又具有 社會屬性,因此人體現象不能籠統用一般生物學規律來解釋。另外,許多醫學實驗和觀察不 允許按研究者的意愿在人體上直接試驗。
3.2 掌握醫學科研的基本程序
①問題提出:愛因斯坦曾說“提出一個問題往往比解決一個問題更為重要,因為解 決一個問題也許是一個數學上或實驗上的技巧。而提出新的問題,新的可能性,從新的角度 看舊問題,卻需要創造性的想象力,而標志著科學的真正進步”。可見,提出科學問題,尤 其是提出概念清晰的難題,更能對科學進步起到真正的推動作用。因此,學生應培養善于觀 察、發現問題的好習慣。②假說建立與驗證:根據經驗和知識,包括文獻、大體分析對象的 內部聯系,提出對該問題的可能答案或解釋,這種預先答案叫假說。進行醫學基礎或臨床實 驗均需先提出假說,然后通過實驗設計、觀察、統計等來對假說進行驗證。③結論與資料解 釋:此為科研中更深刻、更有理論和實踐意義的部分。對在實驗和臨床研究過程中收集的大 量資料和數據進行科學的整理和處理,也就是對臨床觀察的素材進行科學加工,對大量數據 資料進行統計分析,以便為分析判斷,得出科學的結論做好準備。④形成:醫學論 文是醫學研究的一個重要組成部分,完備的醫學論文應具有學術性、科學性和創新性。
3.3 需掌握科研課題的選定
3.3.1 掌握選題的基本要求 ①要有科學性:表現為科研設計是否嚴密、合理 ,研究方法是否正確、完善等。②要有創新性:科研忌無意義重復前人的工作。選題的創新 表現在研究方法、設計是否在前人的基礎上有所改進、提高和創新。③具體明確:醫學研究 的選題必須經過嚴格的核對、分析,真實明確地反映客觀存在的事實。對題目的選定要明確 ,不能含糊不清。④適當實施手段:慎重考慮本人技術水平和所在單位的設備狀況,不能脫 離本人和單位具體情況。
3.3.2 需掌握選題的種類 醫學科研選題分為:①調查研究:流行病學、衛生 學。②實驗觀察:生理學、藥理學,需要實驗條件和觀察手段。③資料分析:需要既往的醫 療衛生資料,統計分析,如死因分析等。④經驗體會:在自己的研究基礎上著重對某一問題 進行探討??傊?科學研究是醫學工作者的重要工作之一,然而,有關的科研方法在醫學院校教育中較 少涉及,僅在研究生培養過程中作為一般內容簡要介紹。因此,許多醫學本科生畢業后不知 怎樣進行科學研究。2000年《中華外科學雜志》的退稿率為74.49%,退稿稿件中科研方法不 正確者占76.25%[3]。表明在醫學科研工作中,科研方法的不合理應用已成為一種 普遍現象。要彌補醫學工作者的這一缺陷,必須加強在校醫學生的醫學科研能力的培養。開 設醫學科研導論課程就是其中一個重要的環節,應引起各類醫學院校的重視。
參考文獻:
[1] 馬克思,恩格斯全集.經濟學哲學手稿[M].1844,42:128.
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1 標準法的改進
1.1 消解方法的改進
為縮短傳統的回流消解時間,早期進行的工作包括密封消解法、快速開管消解法、替代催化劑的選擇等;近期的工作主要包括采用微波消解法、聲化學消解法、光催化氧化法等新技術。
1.1.1替代催化劑的研究 重鉻酸鉀法所用的催化劑Ag2 SO4 價格昂貴,分析成本高。因此,畢業論文研究Ag2 SO4 的替代物,以求降低分析費用有一定的實用性。如以MnSO4 代替Ag2 SO4 是可行的,但回流時間仍較長。Ce ( SO4 ) 2 與過渡金屬混合顯示出很好的協同催化效應,如以MnSO4 - Ce ( SO4 ) 2復合催化劑代替Ag2 SO4[ 1 ] ,測定廢水COD,不但可降低測定費用,還可降低溶液酸度和縮短分析時間,與重鉻酸鉀法無顯著差異。
1.1.2微波消解法 如微波消解無汞鹽光度法測定COD;微波消解光度法快速測定COD;無需使用HgSO4 和Ag2 SO4 測定COD 的微波消解法;氧化鉺作催化劑微波消解測定生活污水COD 等。Ramon[ 2 ]等采用聚焦微波加熱常壓下快速消解測定COD。
與標準回流法相比,微波消解時間從2h縮短到約10min,且消解時無需回流冷卻用水,耗電少,試劑用量大大降低,一次可完成12 個樣品的消解,減輕了銀鹽、汞鹽、鉻鹽造成的二次污染[ 3 ] 。專著[ 4 ]對此作了較全面的總結。
1.1.3聲化學消解法 盡管微波消解時間短,但消解完后要等消解罐冷卻至室溫仍需一定時間。而超聲波消解方便,設備簡單,且不受污染物種類及濃度的限制,近年來已有一些應用研究[ 5 ] 。鐘愛國[ 6 ]使用自制的聲化學反應器對不同水樣進行了聲化學消解試驗,提高了分析效率,減少了化學試劑用量, COD 測定范圍150mg ·L - 1 ~ 2000mg·L - 1 ,標準偏差≤615% ,加標回收率96% ~120%。超聲波消解時,超聲波輻射頻率和聲強是兩個重要的影響因素。試驗表明,超聲波輻射標準水樣30min 時, 低頻( 20kHz) 、適當高的聲強(80W·cm- 2 )有利于水樣的完全消化。
1.1.4光催化氧化法 紫外光氧化快速、高效,在常溫常壓下進行,不產生二次污染,因此對水和廢水分析的優勢特別突出。近幾年來,半導體納米材料作為催化劑消除水中有機污染物的方法已引起了人們的廣泛關注。當用能量等于或大于半導體禁帶寬度(312eV)的光照射半導體時,可使半導體表面吸附的羥基或水氧化生成強氧化能力的羥基自由基( ·OH) ,從而使水中的有機污染物氧化分解。艾仕云等[ 7 ]提出納米ZnO 和KMnO4協同氧化體系,并據此建立了測定COD 的方法,所得結果的可靠性和重現性與標準法相當。他們還使用K2 Cr2O7 氧化劑、納米TiO2 光催化劑測定COD[ 8 ] 。通過光催化還原K2 Cr2O7 生成的Cr3 +濃度變化,可以獲得樣品的COD值。但反應仍需恒溫攪拌,反應液需離心過濾。操作煩瑣,且不能在線快速分析。
1.2 測定方法的改進
1. 2. 1分光光度法 分光光度法測定COD是在強酸性溶液中過量重鉻酸鉀氧化水中還原性物質, Cr6 +還原為Cr3 + ,英語論文利用分光光度計測定Cr6 +或Cr3 +來實現COD 值測定。Inaga 等以Ce ( SO4 ) 2作氧化劑,加熱反應后測定吸光度,計算出COD值。Konno使用自制的比色計與PC機相聯測定COD,所得結果與標準法基本一致。光度法測得COD值快速、準確、成本低等。目前,國內外不少COD快速測定儀均是基于光度法原理。如美國HACH公司制造的COD測定儀是美國國家環保局認可的COD測量方法。
1. 2. 2電化學分析法
(1)庫侖法 庫侖法是我國測定COD的推薦方法,該法利用電解產業的亞鐵離子作庫侖滴定劑進行庫侖滴定, 根據消耗的電量求得剩余K2 Cr2O7 量,從而計算出COD。廣州怡文科技有限公司和中國環境監測總站研制的EST22001COD在線自動監測儀,采用庫侖滴定原理,測量范圍5mg/L~1000mg/L;測量時間30min~60min,測量誤差≤±5% FS;重復誤差≤±3%FS,與手動分析具有很好的相關性。
(2)電解法 此法既不外加氧化劑,也不加熱消解水樣,而是利用電化學原理直接測量水中有機物的含量,是COD測定方法的突破。方法原理基于特殊電極電解產生的羥基自由基( ·OH)具有很強的氧化能力,可同步迅速氧化水中有機物,較難氧化的物質(如煙酸、吡啶等)也均能被·OH氧化。羥基自由基被消耗的同時,工作電極上電流將產生變化。當工作電極電位恒定時,電流的變化與水中有機物的含量成正比關系,通過計算電流變化便可測量出COD 值。作者在這方面作了一些探索工作,取得了初步的結果[ 9, 10 ] 。由于水樣不需消解,極大縮短了分析流程,還克服了傳統方法中“二次污染”的問題。目前,這類儀器代表產品是德國LAR公司的Elox100A型COD在線自動監測儀h[ 11 ] 。儀器測量范圍從1mg/L~10000mg/L,最大可到100000mg/L,測量周期2min~6min。此儀器在歐美各國已得到較廣泛的應用,在我國也獲得國家質量監督檢疫總局計量器具型式批準證書。
(3)其他電化學分析法 Dugin[ 12 ]提出以Ce( SO4 ) 2 為氧化劑,利用pH電極和氧化還原電極直接測定電勢從而測定COD 值的方法。Belius2tiu[ 13 ]以兩種不同的玻璃電極組成電池,通過直接測定電池電動勢, 對水樣中COD值進行測定。趙亞乾[ 14 ]以一定比例的反應溶液回流10min后,冷卻稀釋,用示波器指示終點進行示波電位滴定測定COD。
Westbroek等[ 15 ]提出Pt - Pt/PbO2 旋轉環形圓盤電極多脈沖電流分析法,通過電化學方法產生強氧化劑,碩士論文有機污染物在圓盤電極表面直接氧化或與產生的氧化物質反應而間接被轉化。伏安計時電流法和多脈沖計時電流法測COD,可在幾秒中獲得結果,而且可以在線監測。形成的強氧化媒介可使工作電極表面保持清潔。但方法檢測限較高,不適合地表水或輕度污染水的測定。但德忠等[ 16 ]提出混合酸消解和單掃描極譜法快速測COD 的方法。該法基于用單掃描極譜法測定混合酸(H3 PO4 - H2 SO4 )消解體系中過量的Cr6 + ,從而間接測定COD?;旌纤嵯饣亓鲿r間只需15min。Venkata等[ 17 ]使用示差脈沖陽極溶出伏安法(DPASV)進行電化學配位滴定確定有機金屬絡合物的絡合能力,從而測定COD。
1.2.3化學發光法 根據重鉻酸鉀消解廢水后其最終還原產物Cr3 +濃度與COD值成正比關系,以及在堿性條件下, Luminol - H2O2 - Cr3 +體系產生很強的化學發光的原理,文獻[ 18, 19 ]提出一種用光電二極管做檢測器測定水體化學需氧量的新方法。
1.2.4紫外吸收光譜法 紫外吸收光譜法是通過測量水樣中有機物的紫外吸收光譜(一般用254nm波長) ,直接測定COD。已有工作表明,不少有機物在紫外光譜區有很強的吸收,在一定的條件下有機物的吸光度與COD 有相關性,利用這種相關性可直接測定COD。這種方法不像COD、總有機碳( TOC)方法那樣明確,但在特定水體中有極高的相關性,也能真實反映有機物含量?;谧贤馕赵頊y定COD 的儀器已有生產。這類方法均不需添加任何試劑、無二次污染、快速簡單,但前提條件是水質組成必須相對穩定。此方法在日本已是標準方法,但在歐美各國尚未推廣應用,在我國尚需開展相關的研究。
2 自動在線分析技術
流動分析( FA)用于水樣COD的測定可將樣品消解和測定實現一體化,留學生論文使整個過程實現在線化、自動化。Korinaga[ 20 ]提出以Ce ( SO4 ) 2 為氧化劑,采用空氣整段間隔連續流動分析法對環境水樣中的COD進行測定,采樣頻率達90次/h,但需特制的閥,且管長達18m。陳曉青等[ 21 ]提出測定COD的流動注射停流法,系統以微機控制蠕動泵的啟停,并記錄分光光度計檢測到的信號。由于停流技術的引入,解決了慢反應中樣品的過度分散問題。
Cuesta等[ 22 ]提出COD的微波消解火焰原子吸收光譜- 流動注射分析法。用微波加熱消解樣品,未被樣品中有機物質還原的Cr6 +保留在陰離子交換樹脂上, Cr6 +經洗脫后用火焰原子吸收光譜法測定。這種方法在檢測中沒有基體效應的影響。
盡管流動注射分析的優勢突出,但仍免不了傳統加熱方式。為了提高在線消解效率,不得不加長反應管或采用停留技術,這又導致分析周期延長或低的采樣頻率。醫學論文微波在線消解效果雖好,但去除產生的氣泡使流路結構復雜化。但德忠等[ 23 ]將流動注射和紫外光氧化技術引入高錳酸鹽指數的測定中,建立了紫外光催化氧化分光光度法測定高錳酸鹽指數的流動分析體系,并對多種標準物質(葡萄糖、鄰苯二甲酸氫鉀、草酸鈉等)進行了研究,反應僅需約115min,回收率8310%~11110%,檢測限為016mg/L。用此方法成功測定了COD質控標準(QCSPEX - PEM - WP)和英格蘭普利茅斯Tamar河水樣品。
Yoon - Chang[ 24 ]將光催化劑二氧化鈦鋪助紫外光消解與流動分析技術聯用測定化學耗氧量,獲得了好的相關性。李保新等[ 25 ]把化學發光系統和流動分析法結合測定高錳酸鹽指數,有機物在室溫條件下發生化學氧化反應, KMnO4 還原為Mn2 +并吸附在強酸性陽離子交換樹脂微型柱上,同時過量的MnO-
4 通過微型柱廢棄。吸附在微型
柱上的Mn2 + 被洗脫出來使用H2O2 發光體系檢測。若換用職稱論文重鉻酸鐘氧化劑,在酸性條件下,重鉻酸鉀還原生成的Cr ( Ⅲ)催化Luminol - H2O2 體系產生強的化學發光可測定COD。該方法已用于地表水樣COD的測定。
基于流動技術,綜合電化學技術、現代傳感技術、自動測量技術、自動控制技術、計算機應用技術、現代光機電技術研制的COD 在線監測儀,一般包括進樣系統、反應系統、檢測系統、控制系統四部分。進樣系統由輸液泵、定量管、電磁閥、管路、接口等組成,完成對水樣的采集、輸送、試劑混合、廢液排除及反應室清洗等功能;反應系統主要有加熱單元或(和)反應室,完成水樣的消解和的反應;檢測系統包括單片機(或工控機) 、時序控制和數據處理軟件、鍵盤和顯示屏等,完成在線全過程的控制、數據采集與處理、顯示、儲存及打印輸 參考文獻
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篇4
一、材料與方法
1、材料伊格爾最低濃度必需介質(EMEM)培養基(美國Gibco),胎牛血清(FCS,美國Hyclone),胰酶(美國Sig-ma),PKH26及PKH67(美國Sigma),Hoechst33342(美國Sigma)。JSM—6000F掃描電鏡(日本JEOL公司)。腎小管上皮細胞(HKC)由南京醫科大學楊俊偉教授饋贈,血管內皮細胞(ECV304)由軍事醫學科學院三所細胞室贈送,轉染種子細胞的rAAV2-hNanog重組病毒由北京本元正陽生物技術公司包裝完成,轉染rAAV2-hNanog重組病毒的2種細胞ECV304、HKC由本實驗室制備并保存。
2、中空纖維上混合細胞的分布
2.1混合細胞的PKH26/PKH67標記:將轉染hNanog基因的兩種細胞ECV304及HKC細胞各接種在75cm塑料培養瓶中,置于37℃、體積分數為0.05的CO2孵箱中,用10%的FCSEMEM進行培養。當兩種細胞各生長至匯合時,用0.25%的胰酶消化、離心并沉淀細胞后,然后再用無血清的EMEM洗滌細胞,400g/min離心,共5min,然后棄去上清,使殘留上清不要超過25μl,然后在獲得的細胞沉淀中加入1ml稀釋劑C溶液,輕輕吹打形成細胞懸液;按照PKH26和PKH67試劑盒說明書分別配制4×10-6mol/L的PKH26溶液和4×10-6mol/L的PKH67溶液,然后把ECV304細胞懸液加入到PKH26染液、HKC細胞加入到PKH67染液中,各自吹打均勻,并于室溫下放置2~5min。之后加入2ml血清,室溫下放置1min,再用10%EMEM4ml稀釋上述細胞懸液,25℃條件下1200r/min離心,共10min,棄去上清,去除染色液。用10%EMEM沖洗ECV304、HKC細胞4次,然后將細胞移到另一新管中,加入10ml完全培養基,離心,重懸,使兩種細胞各自的密度調整在(1.0~2.0)×107/ml,然后把兩種轉染細胞ECV304與HKC細胞懸液等體積混合,輕輕吹打均勻,制成混合細胞懸液。
2.2標記細胞的種植:將實驗組及對照組的AV400濾器(Fresenius公司0.7m2)均用無血清的EMEM培養基沖洗,再把無血清EMEM配制的層黏連蛋白0.74mg/ml[1]注入濾器中,置于37℃孵箱中1h,之后將其抽去。然后把標記的種子細胞混合液平均分成4次注入濾器內腔,兩次注射時間間隔為1h,每次注射完畢后按方向標記放置濾器,待下次注射結束后依照固定方向將濾器轉動90°,總共進行4次,完成360°循環。對照組只在AV400濾器中注入不含細胞的培養基,注射方法及放置方法同實驗組。最后把兩組濾器的外腔注滿培養基,置于37℃、體積分數為0.05的CO2孵箱中培養,濾器中培養液pH<7.2時即予以更換。于培養第5天時從兩組濾器中取出中空纖維,用刀片將纖維絲縱向剖開,磷酸鹽緩沖液(PBS)溶液沖洗2次,然后在熒光顯微鏡下觀察2種轉染細胞在中空纖維上的分布。
3、混合細胞在中空纖維上生長狀態的觀察把2種已轉染人Nanog基因的ECV304、HKC置于37℃、體積分數為0.05的CO2孵箱中,用10%FCSEMEM進行培養。當兩種細胞生長至匯合狀態時,用0.25%的胰酶消化,并對2種種子細胞進行細胞計數。實驗組及對照組所用AV400濾器仍用層黏連蛋白包被。把2種轉染細胞的密度調至(1.0~2.0)×107/ml,然后把兩者等體積混合,輕輕吹打均勻,制成混合細胞懸液,然后把細胞混懸液注入濾器內腔,注射方法與放置方法同2.2部分。對照組只在AV400濾器中注入不含細胞的培養基,注射方法及放置方法同實驗組。最后將兩組濾器外腔注滿培養液,置于37℃、體積分數為0.05的CO2孵箱中培養,濾器中培養液pH<7.2時即予以置換。第7天時從兩組濾器中取出中空纖維,用0.1mol/LPBS沖洗1次,然后再用2.5%戊二醛于4℃冰箱中固定2h,之后再用0.1mol/LPBS溶液沖洗,用刀片將中空纖維沿縱向剖開,再用0.1mol/LPBS溶液沖洗2次,最后把剖開的中空纖維置于1%鋨酸中,4℃冰箱中固定1h。標本制作完成后,進行掃描電鏡檢測。
二、結果
1、中空纖維上混合細胞PKH26及PKH67標記檢測:經PKH26染色的ECV304轉染細胞及經PKH67染色的HKC轉染細胞混合種植于聚砜膜中空纖維上后,可見兩種種子細胞呈點片狀分布在聚砜膜中空纖維上。熒光顯微鏡下,ECV304細胞呈現紅色,而HKC呈現黃綠色。而對照組則無紅色或黃綠色的點片狀細胞群分布。
2、中空纖維上混合細胞的生長形態:轉染的ECV304細胞與轉染的HKC細胞混合種植于聚砜膜中空纖維內腔7d后,掃描電鏡檢測:對照組未見細胞生長;混合細胞在中空纖維內腔上呈片狀生長,并可見細胞表面的微絨毛。
三、討論
早期的腎臟組織工程主要是模仿腎小球的濾過功能,人們利用具有類似腎小球濾過功能的生物膜(如聚砜膜)建立了血液透析的方法。然而,血濾器在血透過程中易出現血栓,最終導致濾過功能下降。為解決血濾器中出現血栓的問題,有人將轉染水蛭素基因的內皮細胞種植在生物膜材料上,制成生物人工腎小球[3,4],但這種具有抗凝功能的生物人工腎小球只能對小分子溶質進行清除和濾過,缺乏物質重吸收及內分泌等重要功能。