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及時(shí)章 反向遺傳學(xué)概述

及時(shí)節(jié) 反向遺傳學(xué)產(chǎn)生的背景

反向遺傳學(xué) (eeseeis)是相對(duì)于經(jīng)典遺傳學(xué)而言的一門(mén)方法學(xué) ,在認(rèn)識(shí)反rvregntc向遺傳學(xué)之前 ,首先要了解遺傳學(xué)產(chǎn)生與發(fā)展的過(guò)程 .所謂 "遺傳 ",是指生物通過(guò)各種方式保障生命在自然界中延續(xù) ,并使子代與親代保持某些相似特征的現(xiàn)象 .人們很早就開(kāi)始探討有關(guān)親代和雜交子代之間的性狀遺傳規(guī)律 ,但一直未取得突破性進(jìn)展 .直到1866年奧地利學(xué)者 Mendel根據(jù)他的豌豆雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)表了 .植物雜交試驗(yàn) .的論文,提出兩個(gè)影響深遠(yuǎn)的基本遺傳法則 ,即分離法則 (定律 )(圖1-1)和自由組合法(定律 )(圖1-2),這兩條法則后來(lái)被稱為孟德?tīng)柖?,奠定了現(xiàn)代遺傳學(xué)的基礎(chǔ) (C則ann,2005 ).1909年英國(guó)遺傳學(xué)家 Bateon提出了 "遺傳學(xué) " (genetics)這一學(xué)科名稱,并對(duì)其進(jìn)行了定義 ,認(rèn)為遺傳學(xué)是研究生物的遺傳和變異 ,即研究親子之間異同的生物學(xué)分支學(xué)科 .其研究范圍包括 :遺傳物質(zhì)的本質(zhì)?遺傳物質(zhì)的傳遞和遺傳信息的實(shí)現(xiàn)三個(gè)方面 .自此 ,遺傳學(xué)正式成為一門(mén)學(xué)科 .100余年來(lái) ,遺傳學(xué)家們都是在圍繞這三個(gè)方面進(jìn)行研究 .

1909年,在 Morgan的領(lǐng)導(dǎo)下 ,一批科學(xué)家以果蠅作為遺傳研究的材料 ,在廣泛和深入研究的基礎(chǔ)上 ,提出了第三條經(jīng)典遺傳規(guī)律 ,即連鎖和交換規(guī)律 .但此時(shí)的基因被認(rèn)為只是一個(gè)交換?重組和突變時(shí)無(wú)法再分的單位 ,其物理和化學(xué)性質(zhì)?結(jié)構(gòu)等仍然是個(gè)謎 .1930~1952年,美國(guó)一個(gè)噬菌體研究小組經(jīng)過(guò)一系列的實(shí)驗(yàn) ,最終確定 :DNA是遺傳物質(zhì) (趙壽元和喬守怡 ,2001 ).這一階段的遺傳學(xué)被稱為經(jīng)典遺傳學(xué) ,其研究核心是通過(guò)研究生物的性狀或表型 ,進(jìn)而研究遺傳物質(zhì)的本質(zhì)及遺傳信息的傳遞規(guī)律 .回顧經(jīng)典遺傳學(xué)的發(fā)展歷程 ,不難發(fā)現(xiàn)早期的遺傳學(xué)家都是通過(guò)觀察和研究生物表型和性狀的改變來(lái)探索生物遺傳的規(guī)律 ,解釋遺傳的本質(zhì) ,所使用的一些研究方法主要是研究系譜和雜交育種 ,上述一些遺傳規(guī)律或法則就是運(yùn)用這些研究方法得到的.

圖1-1 孟德?tīng)柗蛛x定律示意圖孟德?tīng)柕姆蛛x定律可表述為一對(duì)等位基因在雜合狀態(tài) (Aa)下,互不干預(yù) ,保持其獨(dú)立性 ,在形成配子時(shí)各自 (A或a)分配到不同配子中 .在一般情況下 ,F1代配子分離比為1∶1 ,F2代基因型分離比為1∶2∶1 ,子二代表現(xiàn)型分離比是3∶1?

1953年 Watson和 Crick提出了 DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型 (圖1-3),Crick繼而于1958年又提出 "中心法則 ".這些理論不僅讓人們了解到遺傳信息的分子結(jié)構(gòu) ,也闡明遺傳信息的傳遞途徑 ,從而開(kāi)創(chuàng)了遺傳學(xué)的新紀(jì)元 ,也標(biāo)志著遺傳科學(xué)進(jìn)入一個(gè)新階段 ,即分子遺傳學(xué)階段 .分子遺傳學(xué)是建立在微生物學(xué)和經(jīng)典遺傳學(xué)的基礎(chǔ)之上,借助生物大分子的研究來(lái)闡明生物的遺傳和變異規(guī)律的遺傳學(xué)分支學(xué)科 .經(jīng)典遺傳學(xué)與分子遺傳學(xué)都是遵循 "性狀 →基因"的研究路線 ,從分析生物個(gè)體的表型入手 ,研究決定這些表型性狀的基因及其調(diào)控序列 .可以說(shuō)分子遺傳學(xué)是遺傳學(xué)發(fā)展的高級(jí)階段 ,經(jīng)典遺傳學(xué)的許多原理已經(jīng)或正在被分子水平的實(shí)驗(yàn)所驗(yàn)證,有的得到進(jìn)一步發(fā)展,有的被修正或擯棄,許多經(jīng)典遺傳學(xué)無(wú)法解決的問(wèn)題或無(wú)法破譯的奧秘也在不斷被解決或揭示.分子遺傳學(xué)的誕生不僅發(fā)展了經(jīng)典遺傳學(xué),也為反向遺傳學(xué)的產(chǎn)生奠定了理論基礎(chǔ).

隨著分子遺傳學(xué)的發(fā)展,許多以基因?yàn)椴僮鲗?duì)象的實(shí)驗(yàn)方法或技術(shù)也在不斷被建立與發(fā)展.例如,1967年吳瑞博士建立了及時(shí)種 DNA測(cè)序方法,即引物延伸測(cè)序策略; Smith等 (1970)發(fā)現(xiàn)了限制性內(nèi)切核酸酶在分子遺傳中的作用,為基因工程奠定了基礎(chǔ);1972年,以 Berg為代表的一批美國(guó)科學(xué)家發(fā)明了人工重組 DNA技術(shù),并得到了及時(shí)個(gè)重組 DNA分子;1974年,人們首次實(shí)現(xiàn)異源真核生物的基因在大腸桿菌中的表達(dá);1975年,美國(guó)的 Temin和 Baltimore在 RNA腫瘤病毒中發(fā)現(xiàn)了反轉(zhuǎn)錄酶,它以 RNA為模板,反轉(zhuǎn)錄生成 DNA,等等 (吳乃虎,2003).如此一系列基因工程技術(shù)的建立與發(fā)展不僅方便了人們?cè)诜肿铀缴蠈?duì)生物遺傳規(guī)律的研究,也為開(kāi)展反向遺傳學(xué)研究提供了技術(shù)支撐.

如前文所述,經(jīng)典遺傳學(xué)遵循 "性狀→基因"的研究路線探討遺傳物質(zhì)的本質(zhì)及遺傳信息的傳遞規(guī)律.但事實(shí)證明,要進(jìn)一步探索生命世界的奧秘,從根本上揭示生命的遺傳規(guī)律,僅走這一條研究路線是不夠的.隨著越來(lái)越多生物體基因的發(fā)現(xiàn)及其序列的測(cè)定,人們發(fā)現(xiàn)可以直接從基因入手開(kāi)展遺傳學(xué)研究,即采用 "基因→性狀"的研究路線.由于這種研究生物遺傳學(xué)的思路是與經(jīng)典遺傳學(xué)研究中所使用的思路逆向而行,所以稱之為反向遺傳學(xué).目前反向遺傳學(xué)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域中,如反向疫苗學(xué)?轉(zhuǎn)基因動(dòng) (植)物?寄生蟲(chóng)學(xué)以及微生物學(xué)等.當(dāng)今比較流行的 RNA干擾(RNA interference,RNAi)?基因敲除 (gene knockout)?反義 RNA (antisense RNA)?基因過(guò)表達(dá) (gene overexpression)?定點(diǎn)誘變 (site-directed mutagenesis)或體外誘變(in vitro mutagenesis)等都屬于反向遺傳學(xué)范疇.

第二節(jié) 反向遺傳學(xué)的概念

廣義的反向遺傳學(xué)泛指從生物基因組及其所含生物信息出發(fā),采用 "基因 →性狀"的研究路線,對(duì)生物體進(jìn)行遺傳和變異規(guī)律的研究,揭示生物的表現(xiàn)型與基因型之間的關(guān)系,探討生命遺傳規(guī)律的分子遺傳學(xué)分支學(xué)科.從方法學(xué)角度而言,反向遺傳學(xué)是在獲得生物基因信息的基礎(chǔ)上,對(duì)基因進(jìn)行操作,來(lái)研究生物基因結(jié)構(gòu)和功能的策略.其所涉及的技術(shù)包括:基因的定點(diǎn)突變?基因插入/缺失和基因置換等.目前,反向遺傳學(xué)已成為最能有力推動(dòng)植物學(xué)?動(dòng)物學(xué)及微生物學(xué)研究的前沿學(xué)科之一.

狹義的反向遺傳學(xué)僅是指對(duì)微生物 (包括細(xì)菌和病毒)的反向遺傳操作和研究,尤其是 RNA病毒的反向遺傳學(xué)操作.這是由于 RNA病毒的基因組一般比較小,更有利于反向遺傳操作.目前已有許多病毒的反向遺傳學(xué)研究系統(tǒng)被建立起來(lái),成功實(shí)現(xiàn)了病毒的體外 "拯救".在此基礎(chǔ)上,人們可以很方便地從基因組入手研究病毒的分子特征?致病機(jī)理?病毒與宿主之間的相互作用以及開(kāi)展新型疫苗的研究等工作,從而開(kāi)創(chuàng)了分子病毒學(xué)研究領(lǐng)域的新局面.

第三節(jié) 反向遺傳學(xué)的原理

由于幾乎所有的基因工程技術(shù)都是以 DNA為操作對(duì)象,因此 DNA病毒的反向遺傳操作相對(duì)容易,許多 DNA病毒的基因組結(jié)構(gòu)與功能?基因的復(fù)制與表達(dá)機(jī)制?分子致病機(jī)理等不斷被揭示,其研究領(lǐng)域也因此得到不斷擴(kuò)展和縱深.相比之下,RNA病毒的分子生物學(xué)研究則顯得較為滯后.因?yàn)榉欠崔D(zhuǎn)錄 RNA病毒的復(fù)制周期并不經(jīng)歷 DNA階段,其基因組分別以各自特有的 RNA形式存在于自然界中,RNA的分子結(jié)構(gòu)特征決定了它的不穩(wěn)定性和易降解性,病毒 RNA一旦脫離病毒核衣殼的保護(hù)就難以存在.因此,在體外操作 RNA病毒基因組比較困難.而反向遺傳操作技術(shù)的發(fā)明改變了這種狀況,通過(guò)將病毒 RNA轉(zhuǎn)換為cDNA,在 DNA分子水平上研究 RNA病毒成為可能,RNA病毒的研究也因此取得巨大進(jìn)展.

RNA病毒反向遺傳學(xué)研究的核心是構(gòu)建感染性cDNA分子克隆,即在獲得病毒基因組序列的基礎(chǔ)上,借助載體構(gòu)建病毒的全長(zhǎng)cDNA分子克隆,同時(shí)將 RNA聚合酶的啟動(dòng)子元件也導(dǎo)入該分子克隆中,通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄過(guò)程,合成病毒 RNA,然后用該轉(zhuǎn)錄物侵染宿主或敏感細(xì)胞系,拯救出與母本病毒具有相同特性的活病毒.這種病毒拯救過(guò)程是針對(duì)正鏈 RNA病毒而言.由于負(fù)鏈 RNA病毒裸露的基因組或由其cDNA轉(zhuǎn)錄而來(lái)的 RNA沒(méi)有感染性,它們必須與核衣殼蛋白?RNA依賴性 RNA聚合酶等形成核糖核蛋白復(fù)合物 (RNP),才能進(jìn)行正常的復(fù)制和病毒粒子的包裝.因此,建立負(fù)鏈 RNA病毒的反向遺傳學(xué)研究系統(tǒng),不僅要構(gòu)建含有病毒全基因組的 cDNA分子克隆,而且要構(gòu)建一些輔助質(zhì)粒,其中含有 RNA復(fù)制酶及核蛋白的編碼序列,然后將這些重組質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞,經(jīng)過(guò)內(nèi)轉(zhuǎn)錄過(guò)程實(shí)現(xiàn)負(fù)鏈 RNA病毒的拯救,如 Schnel等 (1994)將含狂犬病病毒 NP?P和L基因的重組表達(dá)質(zhì)粒與含病毒全長(zhǎng)反義基因組的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染能穩(wěn)定表達(dá)T7 RNA聚合酶的細(xì)胞系,在細(xì)胞內(nèi)形成 RNPs,然后在T7RNA聚合酶的作用下進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯,并裝配成完整的病毒粒子,實(shí)現(xiàn)了狂犬病病毒的拯救 (MertensandDiprose,2004).早期的禽流感病毒的拯救則需要共轉(zhuǎn)染12個(gè)質(zhì)粒,其中包括能轉(zhuǎn)錄8個(gè)基因片段的8個(gè)轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒,以及表達(dá)PB2?PB1?PA和 NP蛋白的4個(gè)表達(dá)質(zhì)粒,后來(lái)建立起轉(zhuǎn)錄/翻譯載體后才把質(zhì)粒數(shù)減少到8個(gè).由于這種拯救病毒來(lái)自于病毒基因組的cDNA分子,因此,可以在 DNA水平上對(duì)病毒基因組進(jìn)行操作,研究拯救病毒基因型的改變對(duì)病毒表型的影響,進(jìn)而對(duì)病毒基因組結(jié)構(gòu)與功能?表達(dá)與調(diào)控進(jìn)行研究,甚至還可以研究病毒的致病機(jī)制?分子免疫機(jī)理等.另外,依賴于反向遺傳學(xué)系統(tǒng),研究者還能設(shè)計(jì)出一種能輸送治療基因的載體,甚至研制出一種毒力減弱的活病毒疫苗以預(yù)防由 RNA病毒引起的許多疾病,這種研究疫苗的方法被稱為反向疫苗學(xué) (reversevac inology)(Sommerfelt,1999).

理論上所有的 RNA病毒都可以通過(guò)構(gòu)建感染性克隆來(lái)開(kāi)展病毒的分子生物學(xué)研究,然而,這種研究策略取決于病毒是否有體外增殖系統(tǒng) (主要是敏感細(xì)胞系).因?yàn)?所構(gòu)建的感染性克隆必須首先能在體外培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)實(shí)現(xiàn)病毒的拯救,然后才能進(jìn)行反向遺傳操作.事實(shí)上,許多 RNA病毒都缺乏敏感細(xì)胞系,如丙型肝炎病毒?諾瓦克病毒?兔出血癥病毒 ,等等 .顯然 ,利用感染性克隆技術(shù)研究這些病毒的致病機(jī)理?遺傳變異和毒力進(jìn)化等是行不通的 .但是 ,利用反向遺傳學(xué)技術(shù)在研究這些病毒的基因組復(fù)制或表達(dá)機(jī)制等方面仍具有明顯的技術(shù)優(yōu)勢(shì) ,這就需要引入復(fù)制子 (replicon)的概念 .通常復(fù)制子是指 DNA中能發(fā)生獨(dú)立復(fù)制的一段 DNA序列 ,在該序列中不僅有復(fù)制原點(diǎn)和復(fù)制終點(diǎn) ,而且含有調(diào)節(jié) DNA復(fù)制的一些順式元件 .在真核生物中 ,DNA的復(fù)制是從許多起始點(diǎn)同時(shí)開(kāi)始的 ,所以每個(gè) DNA分子上有許多個(gè)復(fù)制子 .每個(gè)復(fù)制子都含有一個(gè)復(fù)制起點(diǎn) .原核生物的染色體和質(zhì)粒?真核生物的細(xì)胞器 DNA都是環(huán)狀雙鏈分子 ,它們都是單復(fù)制子 ,都在一個(gè)固定的起點(diǎn)開(kāi)始復(fù)制 ,復(fù)制方向大多數(shù)是雙向的 ,少數(shù)是單向復(fù)制 .就 RNA病毒而言 ,復(fù)制子是指保留了病毒基因組復(fù)制所必需的非結(jié)構(gòu)蛋白編碼基因和非編碼區(qū)的順式作用元件的一種缺陷型基因組 ,它能夠在宿主細(xì)胞內(nèi)有效復(fù)制 ;但由于缺失了結(jié)構(gòu)蛋白編碼基因 ,因此復(fù)制子在細(xì)胞內(nèi)無(wú)法形成感染性的病毒顆粒 .圖1-4是黃病毒科昆津病毒復(fù)制子的結(jié)構(gòu)示意圖 ,該復(fù)制子以外源基因置換了病毒的結(jié)構(gòu)蛋白編碼基因 ,而保留了所有的非結(jié)構(gòu)蛋白和兩側(cè)的非編碼區(qū) (5′/3′ UTR),為便于篩選能支持復(fù)制子持續(xù)性復(fù)制的細(xì)胞系 ,在非結(jié)構(gòu)蛋白的下游還插入一個(gè)抗性基因 .由于抗性基因的表達(dá)受控于外加的內(nèi)部核糖體結(jié)合位點(diǎn)元件 (IRES),而外源基因的表達(dá)則利用昆津病毒的表達(dá)元件來(lái)實(shí)現(xiàn) .因此 ,這種復(fù)制子又被稱為選擇性 (雙順?lè)醋?)復(fù)制子系統(tǒng) .

圖1-4 昆津病毒復(fù)制子結(jié)構(gòu)示意圖 (引自 Pjmata.,2006 )

復(fù)制子在 RNA病毒研究中應(yīng)用非常廣泛 ,而且它的應(yīng)用不受培養(yǎng)系統(tǒng)限制 .因?yàn)榭梢詫?RNA病毒復(fù)制子構(gòu)建成重組質(zhì)粒 ,然后將質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)染細(xì)胞系 ,通過(guò)報(bào)道基因的瞬時(shí)或穩(wěn)定表達(dá)來(lái)評(píng)價(jià)反向遺傳操作對(duì) RNA病毒的復(fù)制或表達(dá)的影響 .此外 ,復(fù)制子系統(tǒng)對(duì)研究一些生物安全級(jí)別比較高的病毒 ,如口蹄疫病毒?新城疫病毒和禽流感病毒等也提供了一個(gè)很方便的操作平臺(tái) ,研究這些病毒的復(fù)制和表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)理等不需要操作具有感染性的病毒就可以實(shí)現(xiàn) .但復(fù)制子在 RNA病毒研究領(lǐng)域中的應(yīng)用 ,更多地體現(xiàn)在新型病毒 ……